Viene presentato un protocollo rapido per la digestione proteolitica con un microreattore triptico a flusso continuo costruito internamente accoppiato a uno spettrometro di massa a ionizzazione elettrospray (ESI). Vengono descritti la fabbricazione del microreattore, la configurazione sperimentale e il processo di acquisizione dei dati.
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Articolo metodologico
Veloce enzimatica Trattamento di proteine per MS rilevamento con un microreattore flusso-through
In questo articolo
Sommario
Abstract
La grande maggioranza di spettrometria di massa (MS) a base di metodi di analisi di proteine implicano un'attività digestione enzimatica prima della rivelazione, tipicamente con tripsina. Questo passo è necessario per la generazione di piccoli peptidi peso molecolare, generalmente con MW <3000-4000 Da, che rientra nell'intervallo di scansione effettiva della strumentazione di spettrometria di massa. protocolli convenzionali coinvolgono O / N digestione enzimatica a 37 ° C. I recenti progressi hanno portato allo sviluppo di una varietà di strategie, tipicamente coinvolge l'uso di un microreattore con enzimi immobilizzati o di una serie di processi fisici complementari che riducono il tempo necessario per proteolitica digestione per alcuni minuti (per esempio, microonde o ad alta pressione). In questo lavoro, si descrive un approccio semplice e conveniente che può essere implementato in qualsiasi laboratorio per la realizzazione rapida digestione enzimatica di una proteina. La proteina (o miscela di proteine) è adsorbito sulla alta perf C18-bonded fase inversaormance particelle di silice cromatografia liquida (HPLC) precaricate in una colonna capillare, e tripsina in tampone acquoso viene infusa in particelle per un breve periodo di tempo. Per attivare il rilevamento on-line MS, i peptidi triptici vengono eluite con un sistema solvente con maggiore contenuto organico direttamente nella sorgente MS ioni. Questo approccio consente di evitare l'uso di particelle ad alto prezzo degli enzimi immobilizzati e non richiede alcun aiuto per il completamento del processo. Protein digestione e l'analisi del campione completo può essere realizzato in meno di ~ 3 min e ~ 30 minuti, rispettivamente.
Introduzione
L'identificazione e la caratterizzazione di proteine purificate si ottiene spesso utilizzando tecniche MS. La proteina viene digerito con un enzima e dei suoi peptidi sono ulteriormente analizzato da MS utilizzando un semplice apparato sperimentale infusione. digestione proteolitica è necessaria per la generazione di piccoli frammenti peptidici che rientrano nel range di massa utile della maggior parte degli analizzatori MS, e che può essere facilmente frammentato attraverso bassa energia di collisione di dissociazione indotta per generare aminoacido informazioni sulla sequenza. Per proteine isolate o semplici miscele proteiche, non vi è alcuna ulteriore nece....
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Protocollo
1. Preparazione del capillare microreattore
- Tagliare il diametro interno 100 micron (ID) x 360 micron di diametro esterno (OD) capillare ad una lunghezza di 7-8 cm, e 20 micron ID x 90 micron OD capillare per 3-5 cm con il coltello capillare di vetro; verifica al microscopio che entrambe le estremità capillari hanno un taglio netto, diritta, senza bave sporgenti.
- Inserire il 20 um ID x 90 micron OD capillare in un'estremità del 100 micron ID x 360 micron OD capillare, per una lunghezza di ~ 6 mm; in caso di necessità, osservare questa operazione al microscopio.
- Applicare una piccola goccia di colla E6000 attorno alla giunzione dei 9....
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Risultati
Un risultato rappresentativo di un processo di digestione proteolitica eseguito contemporaneamente su una miscela di proteine, con le microreattori sopra descritti (figure 1 e 2), è fornita in Tabella 1. La tabella comprende le sequenze peptidiche uniche che identificano una proteina particolare, la croce punteggio correlazione (Xcorr) (ossia, un punteggio che caratterizza la qualità della partita sperimentale-to-teorico per lo spettro di massa .......
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Discussione
Il microreattore descritto in questo lavoro fornisce un facile da implementare apparato sperimentale per mineralizzazione enzimatica delle proteine per permettere l'analisi MS e identificazione in meno di 30 min. I vantaggi di questo sistema, rispetto agli approcci convenzionali, comprendono semplicità, velocità, basso consumo di reagenti e bassi costi. In particolare, non vi è alcuna necessità di costosi perline tripsina immobilizzati e cartucce. La preparazione del microreattore capillare è semplice (Fig.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NSF/DBI-1255991 a IML.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Trappola ionica ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | Lo spettrometro di massa LTQ viene utilizzato per l'acquisizione di dati MS tandem |
| Stadio XYZ | Newport | Parti multiple | Lo stadio XYZ costruito in casa viene utilizzato per adattare la sorgente commerciale LTQ nano-ESI per ricevere input da vari sistemi di erogazione del campione |
| Stereomicroscopio | Ottica Edmund | G81-278 | Il microscopio viene utilizzato per osservare il processo di impacchettamento del microreattore |
| Bilancia analitica/Metler | VWR | 46600-204 | La bilancia viene utilizzata per pesare i campioni di proteine |
| Bagno ad ultrasuoni/Branson | VWR | 33995-540 | Il bagno sonico viene utilizzato per miscelare/omogeneizzare i campioni e disperdere il liquame di particelle C18 |
| Pompa a siringa 22 | Harvard Apparatus | 552222 | La micropompa viene utilizzata per il caricamento, il risciacquo e l'eluizione del campione e dell'enzima su e dal microreattore capillare impaccato |
| Sistema di acqua ultrapura | EMD Millipore | ZD5311595 | Il sistema idrico MilliQ viene utilizzato per preparare l'acqua deionizzata purificata |
| Pipettor/Eppendorf (1.000 µ l) | VWR | 53513-410 | Il pipettatore viene utilizzato per misurare piccoli volumi di soluzioni campione |
| Pipettor/Eppendorf (100 µ l) | VWR | 53513-406 | Il pipettatore viene utilizzato per misurare piccoli volumi di soluzioni campione |
| Pipettor/Eppendorf (10 µ l) | VWR | 53513-402 | Il pipettatore viene utilizzato per misurare piccoli volumi di soluzioni di campioni |
| Capillare di silice fusa (100 &; micro; m ID x 360 µ | TSP100375 | capillare viene utilizzato per la fabbricazione del microreattore | |
| Capillare in silice fusa (20 µ m ID x 100 & micro; | TSP020090 | capillare viene utilizzato per la fabbricazione dell'emettitore ESI | |
| Capillare in silice fusa (50 µ m ID x 360 µ | TSP050375 | capillare viene utilizzato per trasferire i campioni e l'eluente dalla pompa a siringa al microreattore capillare | |
| Mannaia capillare | Supelco | 23740-U | Questo è uno strumento per il taglio di capillari di silice fusa alla lunghezza desiderata |
| Colla | Prodotti Eclettici | E6000 Craft | Questa colla viene utilizzata per fissare l'emettitore ESI nel microreattore capillare o nel chip microfluidico |
| Colla epossidica | Epo-Tek | 353NDT | Questa colla viene utilizzata per sigillare il foro di ingresso microfluidico attraverso il quale vengono caricate le particelle C18 |
| Particelle C18 a fase inversa (5 µ m) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | Si tratta di particelle C18 su cui vengono adsorbite le proteine; le particelle sono state estratte da un 4 mm x 20 cm Colonna LC C18 di Agilent |
| Siringa/vetro (250 µ l) | Hamilton | 81130-1725RN | Le siringhe di vetro vengono utilizzate per caricare il liquame di particelle C18 nel microreattore capillare e per fornire il campione e gli eluenti al microreattore |
| Unione PEEK riducente interna (da 1/16" a 1/32") | Valco | ZRU1.5FPK | Questo raccordo viene utilizzato per collegare il 250 µ l. siringa al microreattore per il caricamento del 5 µ M liquame di particelle |
| Raccordo in acciaio inossidabile (1/16") | Valco | ZU1XC | Il raccordo in acciaio inossidabile viene utilizzato per collegare l'ago della siringa in vetro al capillare per infusione |
| Connettore a T in PEEK per microvolume (1/32") | Valco | MT.5XCPK | Il raccordo a T in Peek viene utilizzato per collegare il capillare di trasferimento del campione al microreattore capillare; sul suo braccio laterale, consente l'inserimento del cavo Pt |
| Connettore a T (peso leggero) | Valco | C-NTXFPK | Questo connettore a T viene utilizzato per applicare la tensione ESI al chip microfluidico attraverso la linea di trasferimento del campione |
| Filo Pt (0,404 mm) | VWR | 66260-126 | Il filo Pt fornisce il collegamento elettrico per la generazione ESI ed è collegato al tubo in PTFE dell'alimentatore ESI per spettrometro di massa |
| (1/16" OD) | Valco | TTF115-10FT | Il tubo in teflon viene utilizzato per consentire un collegamento a tenuta d'aria tra l'ago della siringa e il raccordo in acciaio inossidabile |
| Tubo in PEEK (0,015" ID x 1/16" OD) | Upchurch Scientific | 1565 | Il tubo in Peek viene utilizzato come manicotto per consentire un collegamento a tenuta d'aria tra il raccordo in acciaio inossidabile e il 50 µ m Tubo in PEEK capillare di trasferimento ID |
| (0,015" ID x 1/32" OD) | Valco | TPK.515-25 | Il tubo in Peek viene utilizzato come manicotto per consentire un collegamento senza perdite tra i capillari in silice fusa e il Peek Tee |
| Tagliatubi in polimero tagliato pulito | Valco | JR-797 | Questo cutter viene utilizzato per pre-tagliare 1/16" e 1/32' Tubo in polimero Peek che viene utilizzato come manicotto per connessioni senza perdite in pezzi di ~4-5 cm di lunghezza |
| Fiala ambrata (2 ml) | Agilent | HP-5183-2069 | Le fiale vengono utilizzate per preparare le soluzioni del campione e l'impasto di particelle C18 |
| Flaconcino ambrato (4 ml) | VWR | 66011-948 | I flaconi vengono utilizzati per preparare soluzioni campione |
| Tubo in polipropilene (15 ml) | Fisher | 12-565-286D | Le fiale sono utilizzate per preparare soluzioni tampone |
| Cilindro (100 ml) | VWR | 24710-463 | Il cilindro è utilizzato per misurare i volumi di solvente |
| Cilindro (10 ml) | VWR | 24710-441 | Il cilindro è utilizzato per misurare i volumi di solvente |
| Puntali per pipette (1.000 &; micro; l) | VWR | 83007-386 | I puntali per pipette sono utilizzati per misurare piccoli volumi di soluzioni campione |
| Puntali per pipette (100 &; micro; l) | VWR | 53503-781 | I puntali per pipette sono utilizzati per misurare piccoli volumi di soluzioni campione |
| Puntali per pipette (10 &; micro; l) | VWR | 53511-681 | I puntali per pipette sono utilizzati per misurare piccoli volumi di soluzioni di campioni |
| Substrati di vetro | Nanofilm B270 corona bianca, 3" x 3" | Si tratta di substrati di vetro per la fabbricazione di microchip | |
| Raccordo dado maschio (1/16") | Upchurch | P203X | Questo raccordo viene utilizzato per collegare i capillari di trasferimento al chip microfluidico |
| Gruppo Nanoport | Upchurch | N-122H | Questo raccordo viene utilizzato per collegare i capillari di trasferimento al chip microfluidico |
| Standard proteici | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, grado HPLC | Fisher | A955 | |
| Metanolo, grado | HPLCFisher | A452 | |
| Isopropanolo, grado HPLC | Sigma | 650447 | |
| Acido trifluoroacetico | Sigma | 302031 | |
| Bicarbonato di ammonio | Aldrich | A6141 | |
| Tripsina, grado di sequenziamento | Promega | V5111 |
Riferimenti
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol.
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Ristampe e permessi
