رواية استراتيجية الجمع بين CGH الصفيف وتعاقب كل اكسومي وانهانسر في الرحم في القوارض لتحديد الجينات المسببة لتشوهات الدماغ

Summary

تلين عقيدية هيتيروتوبيا (هايتي) هو الشكل الأكثر شيوعاً لتشوه التنمية القشرية (MCD) في مرحلة البلوغ ولكن الأساس الجيني لا يزال غير معروف في بعض الحالات المتفرقة أكثر. مؤخرا قمنا بتطوير استراتيجية لتحديد الجينات المرشحة رواية ل MCDs وتؤكد على دور العامل المسبّب في فيفومباشرة.

Abstract

العيوب الخلقية التي تنطوي على قشرة الدماغ – المعروف أيضا التشوهات القشرية التنمية (MCD) – أهم أسباب الإعاقة الفكرية وحساب 20-40% من الصرع المقاوم للعقاقير في مرحلة الطفولة. ويسرت تصوير الدماغ عالية الدقة في فيفو تحديد مجموعة كبيرة من MCD تعمل. وعلى الرغم من التقدم الذي تحقق في تصوير الدماغ وتحليل الجينوم وتوليد نماذج حيوانية، سير عمل مباشرة إلى إعطاء الأولوية للجينات المرشحة بشكل منهجي واختبار الآثار الفنية للطفرات المفترضة مفقود. للتغلب على هذه المشكلة، ووضعت استراتيجية تجريبية لتمكين تحديد الجينات المسببة رواية ل MCD والتحقق من صحتها. وتقوم هذه الاستراتيجية على تحديد مناطق الجينوم المرشح أو الجينات عبر الصفيف CGH أو عزمي كل تسلسل ووصف آثار هذه المنظمة أو overexpression من طفرات محددة في تطوير أدمغة القوارض عن طريق الرحم انهانسر. أدى هذا النهج إلى تحديد الجينات C6orf70 ، الترميز لبروتين حويصلية المفترضة، أن الآلية المرضية لتلين عقيدية هيتيروتوبيا، MCD الناجمة عن هجرة الخلايا العصبية التالفة.

Introduction

قشرة الدماغ يلعب دوراً رئيسيا في العمليات الإدراكية والفكرية والمشاركة في التحكم العاطفي، فضلا عن التعلم والذاكرة. ولذلك فإنه ليس من المستغرب أن العديد من الأمراض العصبية والنفسية نتيجة للتشوهات القشرية التنمية (MCD). مسببات MCD معقدة منذ حصلت على حد سواء وتشارك العوامل الوراثية. انتشار نسبة مصممة وراثيا من MCD التراكمي هو حوالي 2% ومتفرقة في معظم الحالات. على سبيل المثال، قدرت حالات الإصابة بخلل الدماغ الخلقي تكون أعلى من 1 في المائة في السكان، ولوحظت بعض أشكال MCD في أكثر من 14 في المائة من جميع المرضى المصابين بالصرع، وفي 40% من الصرع الشديدة أو مستعصية على الحل^{1، 2}.

تلين عقيدية هيتيروتوبيا (هايتي) هو واحد من MCDs الأكثر شيوعاً وهو الناجمة عن الهجرة غير طبيعي للخلايا العصبية من منطقة البطين (VZ) إلى قشرة الدماغ النامي. فشل الخلايا العصبية لترحيل النتائج في مجموعات من الخلايا العصبية هيتيروتوبيك على طول جدران البطينين الجانبية التي يمكن تصور عادة باستخدام “التصوير بالرنين المغناطيسي” (التصوير بالرنين المغناطيسي). السمات السريرية والتشريحية والتصوير ليتبعها غير متجانسة. قد تتراوح العقيدات الصغيرة والاحادية الثنائية ومتماثل. عقابيل السريرية شيوعاً تشمل الإعاقة الفكرية والصرع³. تم العثور على الطفرات في الجين A فيلامين (أو فلنا)، التي تقوم بتعيين في Xq28، في 100 في المائة أسر التي يتبعها الثنائية المرتبطة بالعاشر وفي 26% من المرضى متفرقة^3،4. نموذج نادرة والمتنحية ليتبعها الناجم عن الطفرات في الجينات ARFGEF2 ، التي تقوم بتعيين في 20q13، أبلغ في اثنين من الأقارب الأسر⁵. مؤخرا، تم تحديد بياليليك الطفرات في الجينات ترميز زوج كادهيرين يجند مستقبلات DCHS1 و FAT4 في تسعة من المرضى المصابين باضطراب مولتيسيستيميك التي تتضمن يتبعها⁶. ارتبط أيضا يتبعها الهش × متلازمة⁷، متلازمة ويليامز⁸، متلازمة ميكروديليشن 22q11⁹، والازدواجية في 5 ف 15¹⁰، الحذف في 1 ف 36¹¹، 5q14.3-q15¹², 6 ف 25¹³ و 6q حذف المحطة الطرفية متلازمة^{14،15،16،17،،}من¹⁸¹⁹، مما يوحي بأن الجينات المسببة الإضافية متناثرة في جميع أنحاء الجينوم. ومع ذلك، يبقى الأساس الوراثي حوالي 74 في المائة من المرضى يتبعها متفرقة أن أوضحت¹⁷.

نهج تعيين الجينات الكلاسيكية مثل مصفوفة “التهجين الجينومي المقارن” (صفيف-CGH) أثبتت أن تكون أدوات قوية للكشف عن مجهرية دون تشوهات كروموسومية، بيد مناطق الجينوم وحدد استخدام هذا النهج كبيرة في كثير من الأحيان، وتحتوي على العديد من الجينات.

ظهور تقنيات ضخمة يسلسل موازية (أي كل عزمي التسلسل (ويس) وكل الجينوم تسلسل (WGS)) خفضت إلى حد كبير كل من التكلفة والوقت اللازم لتسلسل أكمله عزمي البشرية أو الجينوم. على الرغم من ذلك، يظل تفسير البيانات ويس والأفرقة العاملة للطعن في معظم الحالات، منذ لكل المتغيرات المريض عشرات إلى مئات (أو حتى الآلاف، واعتماداً من نوع التحليل) الخروج من تصفية البيانات.

لتسريع عملية تحديد الجينات المسببة MCD الجديدة، استراتيجية منهجية رواية الجمع بين CGH صفيف، صمم ويس و في الرحم انهانسر (IUE) فحص الجينات المرشحة. يسمح IUE شكل انتقائي إلغاء تنشيط (أو أوفيريكسبريس) جينات معينة أو الطفرات في أدمغة القوارض، تمكين التقييم السريع لمشاركتهم في^18،كورتيكوجينيسيس¹⁹. [رني] وساطة-ضربة قاضية أو overexpression من واحد أو أكثر من الجينات المرشحة يتوقع أن يتسبب، عندما يكون مرتبطاً بتطوير المرض، وعيوب مترجمة في الهجرة العصبية و/أو النضج الجينات. عند تحديد الجينات التي المنظمة (أو أوفيريكسبريشن) يستنسخ النمط الظاهري لوحظ في المرضى في القوارض، فإنه يصبح أحد المرشحين معلقة لفحص المرضى متفرقة مع MCD. باستخدام هذا النهج، ونحن مؤخرا كشفت مساهمة حاسمة من الجينات C6orf70 (يعرف أيضا باسم ارمارد) في يتبعها المرضية في المرضى إيواء العناصر المحذوفة الصبغية 6q27¹⁶.

Protocol

بيان الأخلاق: ويستار كانت تزاوج صيانتها واستخدامها في مرافق الحيوانات إينميد، باﻻتفاق مع تشريعات الاتحاد الأوروبي والفرنسي. 1. استخراج الحمض النووي والتحديد الكمي ل CGH الصفيف وويس استخراج “الحمض النووي” (جدنا) من الكريات البيضاء في الدم البشري من المرضى الذين يستخدمون…

Representative Results

هو لخص استراتيجية تجريبية تهدف إلى التعرف على الجينات المسببة MCD الجديدة في الشكل 1. قبل تنفيذ CGH الصفيف في مجموعة مرضى 155 بتشوهات الدماغ إنمائية مغايرة الجمع بين يتبعها (الشكل 2A)، وخلل تكون كلثوم الإحضار، كولبوسيفالي، ون…

Discussion

MCDs أهم أسباب الإعاقة الفكرية وحساب 20-40 في المائة من الطفولة المقاوم للأدوية الصرع^1،2. وقد تزايد الاهتمام ب MCDs هائلة خلال العقد الماضي نتيجة لعاملين رئيسيين. الأول هو التحسن في الدماغ التصوير (لا سيما التصوير بالرنين المغناطيسي)، الذي يسمح للأطباء والعلماء ت?…

Materials

Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0002	The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300	Olympus		The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software	Glance Vision Technologies		eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle			Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack			Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven	Agilent	Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid	Agilent	Agilent p/n G8800A or equivalent	Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 or equivalent	Microcentrifuge
Magnetic stir bar	Corning	p/n 401435 or equivalent	Instrument for stirring
Qubit Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent	Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	Pipetman or equivalent		DNA dispensation
Vacuum Concentrator	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 or equivalent	Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA		p/n G1521	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays:	Promega	(female) or p/n G1471 (male)	Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100)	Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner	Agilent		Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit			Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	p/n 5067-4626	Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit			Kit for automated PCR purification.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer			DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit assay tubes	Life Technologies	p/n Q32856	DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	depending on the experiment	Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A	DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates	Agilent	p/n 410088	DNA amplification
Optical strip caps	Agilent	p/n 401425	DNA amplification
Tube cap strips, domed	Agilent	p/n 410096	DNA amplification
Compression mats	Agilent	p/n 410187	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series	Covaris		DNA shearing
Covaris sample holders		p/n 520078	DNA shearing
Nutator plate mixer	BD Diagnostics	p/n 421105 or equivalent	Plate Mixer
GaIIx	Illumina		next generation sequencing machine