Quantitative Fundus autofluorescenza per la valutazione delle patologie retiniche

Introduction

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) supporta la funzione della retina sensoriale attraverso numerosi processi ^1. Età degenerazione maculare (AMD) è la causa più importante di cecità incurabile nei paesi industrializzati ed è caratterizzata da cambiamenti nella RPE, tra cui la perdita di pigmento, perdita della funzione e atrofia. In AMD ed in normale invecchiamento, l'RPE accumula fluorescenti, organelli lisosomi-derivati ​​contenenti frammenti di fotorecettori fagocitati, di cui come granuli di lipofuscina. L'accumulo di RPE lipofuscina è stato pensato per indicare ossidativo disfunzioni ^1, ma recenti studi hanno dimostrato che la morfologia RPE rimane normale negli occhi età con elevati livelli di lipofuscina ^2. Marcatori Tuttavia, i modelli anormali di distribuzione lipofuscina, in particolare la perdita di lipofuscina, sono documentate per la progressione di AMD e AMD, sia istologicamente e clinicamente ^3,4

proces difettosicantare di RPE lipofuscina è stato dimostrato anche che si verifichi in certe degenerazioni retiniche ereditarie. I pazienti affetti da malattia di Stargardt (STGD) si accumulano lipofuscina nel RPE in giovane età, alla fine lo sviluppo di perdita della vista simile a quello visto in AMD ^5. Questi risultati hanno suggerito che l'accumulo di lipofuscina stessa può essere tossico e guidare RPE disfunzioni ^6,7. Tuttavia, uno studio di imaging dettagliata di soggetti con STGD nel corso del tempo non ha confermato che l'accumulo di lipofuscina focale ha portato alla conseguente perdita RPE ^8. Quindi, anche se le anomalie lipofuscina sono marcatori per degenerazioni retiniche, un ruolo per tossicità diretta di lipofuscina ancora da dimostrare.

La RPE è la più strato di cellule posteriore della retina, ma genera la maggior parte del segnale fluorescente dal fondo oculare. Generazione e rilevamento di autofluorescenza (AF) derivato dal RPE possono essere eseguite utilizzando ophthalmoscopy scansione laser confocale (cSLO), che consente visualization della distribuzione spaziale di AF fondo. Alcune degenerazioni retiniche mostrano modelli distintivi del fondo oculare AF, e aiuti di imaging AF nella diagnosi e nel monitoraggio di queste condizioni. Sebbene l'imaging standard di AF è clinicamente importante, AF quantitativa (Qaf) è diventato un importante mezzo per valutare la salute RPE. Noi e altri hanno sviluppato un approccio standardizzato che può determinare in modo affidabile i livelli di Qaf a specifiche posizioni della retina ^9. Qaf ha potenziali applicazioni nella diagnosi e nel monitoraggio delle condizioni della retina, e può anche avere utilità nella prognosi e stratificazione del rischio. Inoltre, la capacità diagnostica di Qaf sono anche stati descritti per certi disturbi della retina ^10-12. Qui, forniamo dettagli graduale per eseguire la nostra tecnica accompagnata da una dimostrazione visiva della sua applicazione nella valutazione di occhi sani e malati.

Protocol

Etica Dichiarazione: Tutti i pazienti arruolati in questi studi sono stati fatti così in conformità approvato revisione istituzionale di Vigilanza presso la New York University School of Medicine.

1. selezione dei pazienti e preparazione iniziale per l'imaging

Nota: Sono necessari i seguenti materiali: 0.5% soluzione oftalmica tropicamide, 2,5% soluzione oftalmica fenilefrina, cSLO dotato di dominio spettrale tomografia a coerenza ottica (SD-OCT), e il riferimento di fluorescenza interna.

1. Prima di immagini, opportunamente istituito cSLO per l'acquisizione dei dati in base alle istruzioni del produttore.
2. Montare un riferimento fluorescente interna nel cSLO. Nota: Il riferimento fluorescente interna, come acquistati dal produttore, è ospitato in un anello di metallo e viene posizionato direttamente dietro l'obiettivo della fotocamera. Se viene utilizzato un cSLO da un altro produttore, ci può essere una configurazione diversa da quella che è descritta inquesto protocollo.
   1. Per inserire il riferimento nella cSLO, ruotare la lente per rimuoverla, svitare ghiera della macchina, e sostituirlo con il nuovo anello metallico contenente il riferimento.
      Nota: il riferimento fluorescente interno è essenziale alla tecnica QaF, in quanto consente la correzione per variazione di potenza del laser e rivelatore di sensibilità / guadagno.
3. Hanno pazienti reclutati per l'imaging sottoposti ad un esame di routine occhio dilatato e ottenere informazioni di base sulla storia passata e oculare condizioni mediche di base che possono manifestarsi con i risultati oculari.
4. Dilatare gli alunni con lo 0,5% e il 2,5% tropicamide fenilefrina. PUNTO CRITICO: Dilata alunni di almeno 6 mm. Nota: Ciò è essenziale per passaggio continuo di luce, e quindi per la visualizzazione ottimale e la misurazione del fondo.
5. Prima di immagini, posizionare il paziente correttamente sul cSLO, con il mento appoggiato sul mentoniera, la fronte posta contro la forehead riposo, e angoli palpebrali laterali correttamente allineati con gli indicatori.

2. Baseline Imaging del fondo oculare

1. In primo luogo, l'immagine del fondo oculare con riflessione della luce infrarossa (IR), vicino (lunghezza d'onda di 820 nm) al fine di centralizzare la fotocamera sopra la macula e ottenere messa a fuoco approssimativa.
   1. Con il paziente posizionato correttamente, attivare l'impostazione hardware sul pannello di controllo per la modalità di imaging IR, macchina fotografica posizionare manualmente fino a quando il fondo è in pieno centro, e prendere una immagine
   2. Regolare l'impostazione sul pannello di controllo per "IR-OCT", che utilizza spettrale dominio tomografia a coerenza ottica (SD-OCT), in combinato disposto con l'imaging a infrarossi per valutare la macula per malattia di base.
   3. Utilizzare le guide presenti nella finestra di imaging per orientare correttamente l'Office per l'immagine IR del fondo. Per ottenere ottimale SD-OCT qualità, posizionare la telecamera in modo tale che l'immagine PTOM nel terzo superiore della finestra di imaging. Acquisire almeno una sc linea orizzontaleuna attraverso la fovea e attraversa l'intero campo di ripresa.

3. Impostazione di Qaf Imaging

1. Utilizzare acquisizione di immagini "ad alta velocità". Nota: Questa impostazione consente per l'acquisizione delle immagini più veloce, che riduce il rischio di perdita del segnale a causa del movimento del paziente e conseguente blocco della luce da parte dell'iride o le palpebre.
2. Utilizzare "Mean di 9" frames. Nota: Questa impostazione consente la rapida, cattura sequenziale di 9 fotogrammi di immagini, che possono essere successivamente "media" per ridurre il rumore e artefatti (vedi sotto).
3. Utilizzare campo "30 x 30 gradi". Nota: Questo si riferisce ai gradi di zona della retina catturati durante l'acquisizione dell'immagine.
4. Prima di imaging, avvertire paziente circa la luce blu, in quanto questo può essere allarmante in un primo momento.
5. Attivare la modalità AF e allineare l'asse della telecamera in modo che lo schermo è al massimo "riempito" con fundus AF (oscuramento minima dei lati e gli angoli dell'immagine).
   1. Se i pazienti have difficoltà a tollerare la luce blu brillante, avviare l'imaging con la telecamera più lontano dall'occhio e quindi portare la fotocamera lentamente verso il paziente fino a quando il fondo è in vista.
      PUNTO CRITICO: Se la luce di entrare in o uscire dall'occhio è ostruito, è diminuito il segnale risulterà. diminuzione localizzata è visibile come oscuramento asimmetrica di un lato un'immagine o un angolo. perdita generalizzata di segnale è visto quando i movimenti degli occhi solo ostruiscono il passaggio della luce.
6. Allineate la telecamera in modo tale che il segnale AF è al livello più alto in tutto il campo. Obiettivo per il segnale massima anziché immagine più nitida, tuttavia essi più o meno correlati. Regolare la messa a fuoco spostando il cSLO per riposizionare la fotocamera manualmente o con il joystick oftalmoscopio.
7. Regolare la sensibilità / guadagno tale da fondo AF è facilmente visibile, ma evitare un eccesso di saturazione. Durante l'acquisizione delle immagini, pixel colorati visibili sia il riferimento interno (situato nella parte superiore dellaimmagine) o fundus indicano sovrasaturazione e quindi perdita di segnale.

4. Acquisizione di immagini

Nota: PUNTO CRITICO: L'obiettivo in acquisizione delle immagini deve essere quello di ottenere 2 qualità 9-cornice dell'immagine pile alte per sessione per controllare la variabilità tra le immagini all'interno di una sessione. Dopo il riposizionamento del paziente e la macchina fotografica, di ottenere una seconda sessione di due immagini per valutare e controllo per la variabilità. Tutte le immagini saranno in ultima analisi, essere calibrati per il riferimento interno (descritto di seguito).

1. Acquisire immagini solo dopo almeno 20 secondi di "sbianca" (piena esposizione della retina alla luce AF) per ridurre al minimo l'assorbimento della luce da parte rodopsina nella retina sensitiva ^9.
   1. Utilizzare questo periodo per ottimizzare l'allineamento della fotocamera, messa a fuoco e sensibilità.
2. Avere i soggetti lampeggiare prima di ogni acquisizione di immagini come un film lacrimale fresca migliora la qualità del segnale.
3. Evitare le palpebre nel piano di acquisizione.
   Nota: Può essere utile manualmente le palpebre aperte per i pazienti più impegnativi. Gli autori raccomandano che un assistente svolge questo compito.
4. Ottimizzare l'allineamento prima di ogni acquisizione delle immagini per assicurare che la luce non sia ostruita da l'iride con conseguente diminuzione del segnale.
   Nota: Come almeno minore movimento è molto comune, gli autori raccomandano bene riallineamento, se necessario, prima di ogni acquisizione delle immagini. Guidare e incoraggiare il paziente, mentre l'imaging aiuta il movimento diminuzione. Gli autori raccomandano anche tramite pedale della macchina come il "tasto di acquisizione" in modo da ridurre al minimo dell'operatore distrazione.
5. Eseguire l'elaborazione post-immagine calcolando il "medio" della pila 9-frame per aumentare il rapporto segnale-rumore. Calcolare la media di una pila usando il software cSLO selezionando l'opzione per calcolare la media.
   Nota: Ci possono essere pile in cui alcuni fotogrammi non sono di qualità ottimale (cioè, hanno localizzata o generalizzata diminuzione SIsegnal rispetto ai telai ottimali), quindi ispezionare accuratamente ogni pila e deselezionare telai subottimali prima calcolo della media.
   Nota: le immagini medie con rapporti accettabili segnale-rumore possono essere trattati da almeno 3 fotogrammi. E 'normale per i lati e gli angoli di ogni immagine di avere segnale inferiori ai 20 gradi centrali a causa di limitazioni all'interno del cSLO stesso.
   1. Se il software chiede se l'operatore vorrebbe normalizzare i livelli di grigio (vale a dire, allungare l'istogramma) tra 0 e 255, selezionare "No". Questo mantiene inalterati livelli di grigio per l'analisi.

Analisi 5. Immagine

1. Analizzare le immagini AF come descritto in precedenza utilizzando il software di analisi delle immagini sviluppato per la tecnica QAF (IGOR; ^9). Una breve descrizione di una tipica analisi delle immagini utilizzando questo software è riportato qui di seguito.
   1. Caricare il programma Qaf in IGOR e importare le immagini (in formato .bmp) esportati dallasoftware cSLO con proporzioni pixel 768 x 768 (parametro di uscita di default).
   2. Selezionare l'immagine nel menu a discesa e di avviare l'analisi.
   3. Riposizionare indicatori di calibrazione sull'immagine in modo tale che il "mirino" si sovrappongono fovea e della "staffa" confina con la disco ottico (questi indicatori sono utilizzati per scalare e posizionare i ROI). Una volta posizionato correttamente, il software utilizzare i prompt quindi popolare l'immagine con ROI circolari che circondano la fovea (vedi figure 1, 2).
   4. Selezionare l'opzione in IGOR per calibrare i livelli di grigio complessivi di ciascuna immagine a quei livelli presenti nel riferimento fluorescente interna. Nota: Questa fase consente di calibrare fattori correlati alla macchina, compreso il livello elettronico zero ogni immagine e il fattore di calibrazione di riferimento interno di ogni macchina, così come i fattori correlati al paziente, quali l'età, rifrazione e curvatura corneale.
      Nota: Il software di analisi mostra poi il r fissoegioni sull'immagine risultante e un valore di Qaf è dimostrata all'interno di ogni regione. I valori Qaf vengono anche inseriti automaticamente in un formato foglio di calcolo in una finestra separata. "
   5. Generate "mappe di calore" Qaf selezionando l'opzione entro i prompt dei comandi. Tutte le immagini e dati possono essere esportati dal software IGOR in un foglio di calcolo Excel selezionando le opzioni appropriate.

Representative Results

Questa tecnica è stata utilizzata per studiare QaF in entrambi i sani e ¹³ di malattia stati ^10-12. In occhi sani (Figura 1), AF emessa dal RPE è distribuito in modo relativamente uniforme in tutto il fondo (Figura 1A). intensità ridotta è visto nella regione maculare centrale dovuto al blocco della luce da pigmento maculare, e ai lati ed angoli dell'immagine dovuto l'ottica dell'occhio e fotocamera. Vasi appaiono scure e dovrebbero essere a fuoco chiaro nelle immagini acquisite ben-. Figura 1B mostra una corrispondente rappresentazione mappa di calore dei livelli Qaf dalla figura 1A. colori freddi corrispondono ad aree di minore intensità, mentre i colori più caldi corrispondono alle aree di maggiore intensità. Intensità massima è generalmente visto nel secondo anello 8 segmenti concentrici (indicata in Figura 1B). Questa regione è anche meno soggetti a relative immagini variabillità rispetto alle regioni più vicine ai bordi dell'immagine, ed è al di fuori della regione centrale dove macula pigmento ha un grande impatto sui livelli di Qaf. Così, le intensità medie di questo anello sono utilizzati per la maggior parte dei dati analisi ^13. La figura 2 presenta un'analisi di rappresentanza in un occhio con AMD dimostrando atrofia geografica (GA), una forma avanzata di AMD. Questa forma di risultati AMD in aree localizzate di perdita RPE, evidenziato da marcatamente ridotta o assente AF, e provoca la perdita progressiva della visione centrale.

Figura 1. autofluorescenza nell'occhio sano. Immagine (A) autofluorescenza (AF) dell'occhio destro di un paziente normale. OD: disco ottico, Fo: fovea, Ma: macula, Rif: riferimento interno. (B) post-processing Qaf mappa immagine AF di da (A). colori più caldi in correlazione con l'intensità AF superiore. reg fissaioni sono mostrate, e sono indicati valori qaf di ciascuna regione. Anello di 8 segmenti perifoveal utilizzato in analisi dei dati è indicato dalla linea tratteggiata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. autofluorescenza nell'occhio visualizzazione atrofia geografica causa di AMD. (A) autofluorescenza (AF) immagine dell'occhio sinistro di un paziente con AMD avanzato mostrando atrofia geografica (GA) della RPE (regione rappresentante circoscritta dalla linea tratteggiata). OD: disco ottico, Fo: fovea, Ma: macula, Rif: riferimento interno. Nota marcatamente ridotta e assente AF a quelle corrispondenti al GA nella macula. (B) post-processing Qaf mappa immagine AF di da (A). regioni fisse sono mostrati, e valori QaF di ogni regione unri indicato. Anello di 8 segmenti perifoveal utilizzato in analisi dei dati è indicato dalla linea tratteggiata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Anormale distribuzione lipofuscina RPE, sia aumentato o diminuito, è un marcatore sensibile della malattia retinica ed è generalmente associata a perdita di funzione retina sensitiva. Qui, descriviamo l'applicazione di Qaf per la valutazione dei RPE lipofuscina. Costituzione di un riferimento fluorescente interna per correggere per la variabile potenza del laser e rilevatore di sensibilità ⁹ a fianco della nostra tecnica di imaging standardizzata consente una quantificazione affidabile dei livelli di AF. Il nostro obiettivo è che questo metodo sarà di aiuto nella diagnosi e nel monitoraggio delle malattie della retina, e, infine, nel valutare l'efficacia degli interventi terapeutici, come la terapia farmacologica o genetica. Qaf può anche aiutare nella stratificazione degli individui a rischio per condizioni come l'AMD.

Abbiamo generato una grande banca dati normativa di dati QaF per essere usato come strumento di riferimento per l'interpretazione della patologia retinica ^13, e hanno anche descritto QaF in diversi sta malattiaTES, tra cui la malattia di Stargardt ^10, del toro occhio maculopatia ¹² e malattia di Best ^11. In retina sana, ci sono diversi livelli di Qaf tra gruppi etnici, con significativamente più alta QaF nei bianchi che neri e gli asiatici, e ha dimostrato che le donne hanno livelli di Qaf più elevati rispetto agli uomini. Forse la cosa più sorprendente, QAF aumenta come i pazienti di età, che corrisponde con i livelli di RPE lipofuscina, come precedentemente misurato da spettrofluorimetria ^14. Sebbene corrente dati normativa si estende solo fino a 60 anni, sembra che i pazienti hanno una diminuzione misurata nel RPE lipofuscina dopo 70 ^{di 14} anni. È interessante notare che, non sembra che i cambiamenti nel numero di cellule RPE si verificano come i pazienti di età ² e così i cali osservati in AF può essere dovuto ad una ridistribuzione o riduzione RPE lipofuscina ^3. Sarà interessante verificare se queste diminuzioni in AF in età avanzata in correlazione con la funzione RPE compromessa e aumento del rischio di AMD.

15. Un'altra limitazione è che la tecnica è difficile da eseguire ed è altamente dipendente dell'operatore. E 'essenziale per ottenere costantemente immagini di alta qualità per garantire misure accurate dei livelli di AF. Per raggiungere questo obiettivo, gli autori suggeriscono stretta aderenza al protocollo di imaging e pratica adeguata. Anche se alcuni pazienti mal tollerano le brillanti lampi di luce necessaria per l'imaging AF, assicurando i pazienti che i livelli di esposizione sono ben entro i limiti di sicurezza è utile ^1. Per consentire per l'imaging ottimale, è fondamentale per dilatare gli alunni ad almeno 6 mm e per ottenere più immagini con la trasmissione della luce libera (vedi sopra). Il raggiungimento di messa a fuoco ottimale ed evitando sovrasaturazione di pixel sono anche essenziali. pratiche utili includono la comunicazione con il paziente durante l'imaging, l'uso di un assistente se la palpebra deve essere sollevato e usare il pedale per l'innesco della fotocamera, come descritto sopra.

In sintesi, unprensione della fisiopatologia della RPE a degenerazioni retiniche rimane un'area di ricerca attiva, e potenzialmente importante impatto terapeutico. Per quanto Qaf permette la comparazione diretta dei livelli di AF nelle immagini ottenute longitudinalmente, tra i pazienti e tra i centri, si tratta di uno strumento prezioso che può contribuire a questa comprensione, oltre a fornire utili informazioni cliniche. Il protocollo dettagliato qui delineato sarà aiutare gli altri per l'acquisizione di dati affidabili Qaf, e che le importanti applicazioni cliniche di Qaf incoraggerà i centri di ricerca e specialisti clinici retina di fare uso della tecnica Qaf.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0.5% tropicamide ophthalmic solution			Any brand can be used
2.5% phenylephrine ophthalmic solution			Any brand can be used
Internal fluorescent reference	Heidelberg Engineering
IGOR Pro software	WaveMetrics