Summary
यहाँ, हम माउस oocytes में अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी विधानसभा और संगठन का मूल्यांकन करने के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के बाद विशिष्ट siRNA की मध्यस्थता mRNA कमी के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस प्रोटोकॉल के टेप की इन विट्रो कमी और विभिन्न धुरी और / या oocytes में MTOC जुड़े कारकों के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है।
Introduction
अर्धसूत्रीविभाजन युग्मक (oocytes और शुक्राणु) में होता है और अर्धसूत्रीविभाजन I और अर्धसूत्रीविभाजन II, क्रमश: 1 के दौरान मुताबिक़ क्रोमोसोम और बहन क्रोमेटिडों को अलग करने के लिए डीएनए संश्लेषण हस्तक्षेप के बिना लगातार दो डिवीजनों शामिल है कि एक अद्वितीय विभाजन की प्रक्रिया है। Oocytes में अर्धसूत्रीविभाजनिक विभाजन के दौरान गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियाँ निषेचन के दौरान भ्रूण से विरासत में मिली है जो aneuploidy, हो सकती है। उल्लेखनीय है कि विकासशील भ्रूण में aneuploidy की घटनाओं को मातृ उम्र में आगे बढ़ने के साथ बढ़ जाती है और महिलाओं 1,2 में गर्भावस्था के नुकसान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जन्मजात जन्म दोष का एक प्रमुख कारण है, इस प्रकार, अर्धसूत्रीविभाजनिक विभाजन के दौरान aneuploidy के आणविक आधार को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता को रेखांकित ।
कोशिका विभाजन के दौरान, गुणसूत्र अलगाव विपरीत धुरी करने के लिए सही कुर्की के लिए सूक्ष्मनलिका धुरी तंत्र और स्थिर गुणसूत्र-सूक्ष्मनलिका बातचीत की स्थापना का विधानसभा पर महत्वपूर्ण निर्भर हैडंडे। महत्वपूर्ण बात है, स्तनधारी oocytes में अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी गठन दैहिक कोशिकाओं में बँटवारा से अलग है, और अद्वितीय सूक्ष्मनलिका आयोजन केन्द्रों centrioles 3,4 कमी है कि (MTOCs) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। सूक्ष्मनलिका न्यूक्लिएशन और संगठन के लिए आवश्यक आवश्यक प्रोटीन सूक्ष्मनलिका विधानसभा उत्प्रेरित कि γ ट्यूबिलिन सहित डिम्बाणुजनकोशिका MTOCs, करने के लिए स्थानीय बनाना। इसके अलावा, MTOCs 5 में बांधता है जो एक आवश्यक मचान प्रोटीन, के रूप में कार्य करता है और एंकर γ ट्यूबिलिन के साथ ही अन्य कारकों pericentrin। विशेष रूप से, हमारे अध्ययन कुंजी MTOC जुड़े प्रोटीन की कमी अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी संगठन बाधित और पूरी तरह से धुरी विधानसभा चेकपॉइंट (सैक) 6.7 द्वारा हल नहीं कर रहे हैं, जो oocytes में गुणसूत्र अलगाव त्रुटियों की ओर जाता है कि प्रदर्शित करता है। इसलिए, अर्धसूत्रीविभाजनिक गिरफ्तारी को ट्रिगर नहीं है कि धुरी स्थिरता में दोष, aneuploidy में योगदान करने में एक महत्वपूर्ण जोखिम मुद्रा। धुरी विधानसभा और संगठन, डिम्बाणुजनकोशिका MTOC prot में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूदein संरचना और समारोह समझ खराब रहता है।
कोशिकाओं शीघ्र ही अर्धसूत्रीविभाजन 8,9 की बहाली से पहले transcriptionally मौन हो के रूप में स्तनधारी oocytes में विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन के समारोह परीक्षण, चुनौती दे रहा है। इसलिए, पूर्व ovulatory oocytes अर्धसूत्रीविभाजन को फिर से शुरू करने के लिए मातृ mRNA दुकानों पर भरोसा करते हैं और अर्धसूत्रीविभाजनिक विभाजन के रूप में अच्छी तरह से निषेचन 10,11 के बाद पहली दरार डिवीजनों समर्थन करते हैं। स्तनधारी oocytes में mRNA टेप की शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) मध्यस्थता गिरावट की प्रभावकारिता अच्छी तरह से स्थापित है और अर्धसूत्रीविभाजनिक परिपक्वता के दौरान अनुवाद के लिए भर्ती मातृ आरएनए siRNA 12-14 को लक्षित करने के लिए विशेष रूप से उत्तरदायी हैं। इसलिए, oocytes में कम दखल RNAs के microinjection (siRNAs) कार्यात्मक परीक्षण के लिए लक्ष्य mRNAs गिरेगा के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान करता है।
यहाँ, हम माउस oocytes और विशिष्ट transcri की siRNA की मध्यस्थता कमी के अलगाव के लिए विधियों का वर्णनअंक pericentrin, एक आवश्यक MTOC जुड़े प्रोटीन के समारोह का परीक्षण करने के लिए। इसके अलावा, हम oocytes में अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी गठन का मूल्यांकन करने के immunofluorescence विश्लेषण की स्थिति का वर्णन है।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल जॉर्जिया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. तैयारी
- हौसले डिम्बाणुजनकोशिका संस्कृति, खरीद या के लिए न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) तैयार करने और तालिका 1 में उल्लिखित के रूप में 3 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ पूरक। (शून्य करने के लिए बारदाना) एक लोडिंग संतुलन पर एक polystyrene बोतल रखें। आदेश में, बीएसए को छोड़कर, सभी अभिकर्मकों जोड़ें और 250 ग्राम की कुल करने के वजन से MQ-पानी के साथ अंतिम मात्रा को ले आओ। फिर, बीएसए जोड़ने भंग करने और फिल्टर बाँझ अनुमति देते हैं।
नोट: वर्णित सदस्य मध्यम 5% सीओ 2, 5% 2 हे और 90% 2 एन के एक मेडिकल गैस मिश्रण के साथ संतुलन और सेल ऊष्मायन की आवश्यकता है। हालांकि, अन्य मीडिया (जैसे, CZB) वायुमंडलीय परिस्थितियों में 5% सीओ 2 में सेल ऊष्मायन के लिए अनुमति देते हैं कि इस्तेमाल किया जा सकता है। - डिम्बाणुजनकोशिका microinjection के लिए, खरीद या M2 मध्यम तैयार करते हैं।
- पी तैयार5 आइयू / 100 μl की एकाग्रता के लिए शासक घोड़ी का सीरम गोनाडोट्रोपिन (PMSG)।
- खरीद और 1 माइक्रोन के एक काम एकाग्रता के लिए siRNA शेयरों पुनर्गठित।
2. माउस Oocyte संग्रह
- दिन 1: डिम्बग्रंथि कूप विकास को प्रोत्साहित और पूर्व ovulatory के रोम की संख्या में वृद्धि, intraperitoneally डिम्बाणुजनकोशिका संग्रह करने के लिए 48 घंटे से पहले मादा चूहों को PMSG के 5 आइयू प्रशासन।
- दिन 3: डिम्बाणुजनकोशिका संग्रह और संस्कृति के लिए, 1 माइक्रोग्राम / एमएल milrinone के साथ पूरक सदस्य / बीएसए के 3 मिलीलीटर के साथ 35 मिमी संस्कृति व्यंजन की स्थापना की। इस फॉस्फोडाइस्टरेज़ अवरोध करनेवाला में oocytes का कहना है प्रोफेज़-मैं की गिरफ्तारी और कीटाणु पुटिका टूटने (GVBD) को रोकता है। कम से कम 15 मिनट के लिए एक चिकित्सा गैस मिश्रण में संस्कृति व्यंजन संतुलित करना।
नोट: Milrinone पूरक मीडिया डिम्बाणुजनकोशिका संग्रह, साथ ही डिम्बाणुजनकोशिका microinjection और 24 घंटा संस्कृति पकड़ अवधि पोस्ट siRNA भर की आवश्यकता है। - 15 प्रथाओं स्थापित प्रयोगशाला का उपयोग कर मादा चूहों से अंडाशय निकालते हैं और पूर्व गर्म के साथ एक नई संस्कृति डिश को हस्तांतरण और सदस्य / बीएसए / milrinone equilibrated।
- डिम्बाणुजनकोशिका संग्रह के लिए एक stereomicroscope के मंच पर संस्कृति डिश रखें। रिलीज मेघपुंज-डिम्बाणुजनकोशिका-परिसरों (सीओसी) की मैन्युअल 27 जी सुइयों के साथ कोटरीय के रोम puncturing द्वारा। 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक 27 जी सुई के साथ, संस्कृति डिश के नीचे करने के लिए एक अंडाशय फिक्स, और सभी बड़े के रोम पंचर करने के लिए एक दूसरे की सुई का उपयोग करें। प्रत्येक अंडाशय के लिए दोहराएँ।
- कॉम्पैक्ट मेघपुंज कोशिकाओं के 2 या अधिक परतों से घिरे रहे हैं कि सभी oocytes जमा है, मानक मुंह pipetting प्रक्रियाओं या डिम्बाणुजनकोशिका आकांक्षा के अन्य साधनों का उपयोग करना। एक नई डिश के लिए सीओसी के स्थानांतरण और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- ध्यान से 750 μl की एक आकांक्षा मात्रा करने के लिए सेट 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ दोहराया कोमल pipetting द्वारा आसपास के मेघपुंज कोशिकाओं को हटा दें। Pipetting के कदम के बारे में 12 बार दोहराएँऔर oocytes 5 मिनट के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं। सभी या मेघपुंज कोशिकाओं के सबसे हटा दिया गया है जब तक इस तरह से जारी रखें। एक और संस्कृति डिश के लिए denuded oocytes स्थानांतरण और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संतुलित करने की अनुमति देते हैं।
- के लिए खाते में ब्याज के लक्ष्य के मुकाबले विशिष्ट siRNAs (i) microinjection, unspecific (नियंत्रण) siRNAs (ii) microinjection, और (iii) एक गैर इंजेक्शन नियंत्रण समूह: तीन प्रयोगात्मक समूहों में denuded oocytes आवंटन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा संस्कृति की स्थिति।
3. Oocyte microinjection
- डिम्बाणुजनकोशिका microinjection के लिए milrinone (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक 3 मिलीग्राम M2 के मीडिया के साथ संस्कृति बर्तन सेट करें। कपड़े धोने और इंजेक्शन oocytes के बाद संस्कृति के लिए सदस्य / बीएसए / milrinone युक्त संस्कृति व्यंजन तैयार करें।
नोट: एम 2 मध्यम HEPES बफर में शामिल है और वायुमंडलीय परिस्थितियों में 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व वार्मिंग की आवश्यकता है। सदस्य का वर्णन के रूप में चिकित्सा गैस के प्रयोग से पूर्व वार्मिंग और संतुलन की आवश्यकता हैऊपर घ। - Microinjection सिस्टम तैयार करें। 1 माइक्रोन विशिष्ट siRNA समाधान के 5 μl के साथ इंजेक्शन सुई लोड। Microinjection प्रणाली के micromanipulators को पकड़े पिपेट और इंजेक्शन की सुई को सुरक्षित और calibrated मात्रा और दबाव के साथ इंजेक्शन यूनिट की स्थापना की।
- एक 3 सेमी संस्कृति डिश के ढक्कन के अंदर पर M2 के मीडिया के एक 200 μl सूक्ष्म बूंद रखें और सेट अप और microinjection प्रणाली के संरेखण के लिए एक डिम्बाणुजनकोशिका जोड़ें।
- एक गाइड के रूप में डिम्बाणुजनकोशिका का उपयोग करना, होल्डिंग और इंजेक्शन सुई के पदों को समायोजित। धीरे डिम्बाणुजनकोशिका सुरक्षित और सेल की व्यापक व्यास को इंजेक्शन सुई की स्थिति को समायोजित करने के लिए पकड़े विंदुक के लिए नकारात्मक दबाव लागू करें। कहीं भी डिम्बाणुजनकोशिका कोशिका द्रव्य में siRNA समाधान के लगभग 10 पी एल के microinjection अनुमति देने के लिए सेटिंग्स समायोजित करें।
चित्रा 1. Oocyte microinjection की स्थापना की। ( - Stereomicroscope चरण के ढक्कन लौटें और ताजा M2 के मीडिया के एक 200 μl सूक्ष्म बूंद जोड़ें। मुंह pipetting, या वैकल्पिक तरीकों से सूक्ष्म ड्रॉप करने के लिए oocytes के एक समूह (~ 10) जोड़ें, तो microinjection चरण के लिए माइक्रो-बूंद के साथ ढक्कन वापसी।
- व्यक्तिगत oocytes microinject करने के लिए आगे बढ़ें। धीरे-धीरे कोशिका द्रव्य में इंजेक्शन सुई की नोक डालें, पकड़े विंदुक के साथ एक डिम्बाणुजनकोशिका को सुरक्षित और siRNA समाधान के इंजेक्शन की मात्रा को निष्कासित। ध्यान से इंजेक्शन की सुई और मो वापस लेनामाइक्रो-बूंद के तल पर एक स्थिति के लिए इंजेक्शन डिम्बाणुजनकोशिका किया है। माइक्रो-बूंद के शीर्ष पर एक स्थिति के लिए असफल इंजेक्शन oocytes ले जाएँ।
- प्रत्येक डिम्बाणुजनकोशिका साथ microinjection प्रक्रिया को दोहराएँ। एक समय में इष्टतम डिम्बाणुजनकोशिका व्यवहार्यता, oocytes की microinject केवल एक छोटी संख्या बनाए रखने के लिए। इस प्रक्रिया को माइक्रो-बूंद में तापमान और पीएच परिवर्तन को रोकने के लिए कुछ मिनट से अधिक नहीं ले करता है कि सुनिश्चित करें।
- महाप्राण सफलतापूर्वक oocytes इंजेक्शन या ध्यान से stereomicroscope के लिए इंजेक्शन oocytes की सूक्ष्म गिरावट के साथ ढक्कन चलते हैं। धोने और 37 डिग्री सेल्सियस पर संतुलित करने के लिए / बीएसए / milrinone मध्यम मेम को, मुंह pipetting या वैकल्पिक तरीकों द्वारा इंजेक्शन व्यवहार्य oocytes स्थानांतरण।
- Oocytes की एक और समूह का उपयोग करना, नियंत्रण समूह के लिए गैर विशिष्ट siRNAs के साथ भरी हुई एक नया इंजेक्शन सुई के साथ microinjection प्रक्रिया को दोहराएँ। एक अलग संस्कृति डिश के सदस्य / बीएसए / milrinone और हस्तांतरण में oocytes धो लें।
- की संस्कृति सभी समूहोंचिकित्सा गैस का अहसास के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर सदस्य / बीएसए / milrinone में 24 घंटे के लिए oocytes।
नोट: 'milrinone ब्लॉक' संस्कृति अवधि कुशल लक्ष्य mRNA / प्रोटीन की कमी के लिए आवश्यक है।
Meiotic परिपक्वता के लिए 4. Oocyte संस्कृति
- 4 दिन: oocytes की प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए 3 मिलीलीटर सदस्य / बीएसए के साथ सेट-अप 4 संस्कृति व्यंजन (35 मिमी)। डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के लिए उपयोग करने के लिए 10% (उच्च गुणवत्ता) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ समूह के प्रति एक मीडिया पकवान अनुपूरक। सभी संस्कृति व्यंजन चिकित्सा गैस मिश्रण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संतुलित करने की अनुमति दें।
- क्रमिक रूप से, 'milrinone ब्लॉक' से oocytes रिलीज सदस्य / बीएसए युक्त व्यंजन में oocytes तीन बार धोने और फिर 10% FBS के साथ मीडिया से युक्त परिपक्वता डिश के लिए oocytes स्थानांतरण करने के लिए। संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर 17 घंटे के लिए सभी डिम्बाणुजनकोशिका समूहों, बहाली और अर्धसूत्रीविभाजन की प्रगति को सक्षम करने के लिए।
- दिन 5: डिम्बाणुजनकोशिका fixa के लिए तैयार समाधानमोर्चे, जिनमें शामिल हैं: (i) पीईएम बफर में 4% paraformaldehyde (पीएफए) (100 मिमी पाइप [पीएच 6.9], 1 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी EGTA) 0.5% ट्राइटन एक्स 100, और (ii) पीबीएस 5 के साथ पूरक के साथ धोने और oocytes ब्लॉक करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि% FBS।
नोट: ये समाधान से पहले डिम्बाणुजनकोशिका निर्धारण करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक वार्मिंग पूर्व की आवश्यकता होती है। - (17 घंटा संस्कृति के बाद) डिम्बाणुजनकोशिका निर्धारण के लिए, तेजी के 750 μl युक्त मुंह pipetting या (एक 4 अच्छी तरह से पकवान की) व्यक्तिगत कुओं में वैकल्पिक तरीकों से oocytes की प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह हस्तांतरण 4% पीएफए समाधान पूर्व गर्म और 37 पर सेते 1 घंटे के लिए सी °। इसके बाद 5% FBS युक्त पूर्व गर्म पीबीएस के 750 μl में 3 बार (15 मिनट प्रत्येक) oocytes के प्रत्येक समूह धो लें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 μl पीबीएस / 5% FBS हे / एन में ब्लॉक oocytes बाध्यकारी unspecific एंटीबॉडी को कम से कम करने के लिए।
5. immunofluorescence विश्लेषण
- दिन 6:
नोट: Immunostaining एक बहु अच्छी तरह से थाली और OOC में किया जाता हैytes क्रमानुसार संबंधित एंटीबॉडी और धोने के समाधान युक्त, अनुक्रमिक कुओं के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। या तो 48 या 96 अच्छी तरह प्लेटें इस्तेमाल किया जा सकता है, बस अच्छी तरह से आकार के आधार पर समाधान मात्रा समायोजित करें। 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रति 200 μl का उपयोग करें। - 3 धोने कुओं - माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान - 3 धोने कुओं प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान: oocytes निम्न क्रम में अलग अलग समाधान करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। प्लेट पन्नी के साथ कवर किया जा सकता प्रकाश जोखिम सीमित करने के लिए।
ताजा पीबीएस / 5% FBS को तैयार है और एंटीबॉडी dilutions तैयार करने के लिए इस समाधान का उपयोग (जैसे, खरगोश विरोधी pericentrin (1/1000), माउस विरोधी ट्यूबिलिन (1/1000))। - प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के (कम मात्रा वांछित है, तो या 100 μl) 200 μl युक्त व्यक्तिगत कुओं के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह की अचल oocytes स्थानांतरण और अच्छी तरह से parafilm के साथ कवर किया। इष्टतम एंटीबॉडी विशिष्ट परिस्थितियों के अनुसार सेते हैं (उदाहरण के लिए, 1 घंटा, या 4 डिग्री सीओ / N के लिए 37 डिग्री सेल्सियस)।
नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी dilution के रूप में अच्छी तरह के रूप में विशिष्ट ऊष्मायन समय और तापमान इस्तेमाल विभिन्न एंटीबॉडी के लिए इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए परीक्षण की आवश्यकता होती है। - प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद, पीबीएस / 5% FBS (10-15 मिनट प्रत्येक) में oocytes तीन बार धोएं।
- Fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान में oocytes स्थानांतरण (जैसे, अलग तरंग दैर्ध्य की fluorochromes के साथ संयुग्मित विरोधी खरगोश और विरोधी माउस एंटीबॉडी के 1/1000 कमजोर पड़ने)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
- (- 15 मिनट प्रत्येक 10) पीबीएस / 5% FBS में oocytes तीन बार धोएं।
- अंतिम धोने के कदम के बाद, एक साफ गिलास स्लाइड पर oocytes स्थानांतरण और धीरे से किसी भी अतिरिक्त धोने समाधान महाप्राण। यह कांच की सतह पर oocytes स्थिर करना होगा। मीडिया (DAPI युक्त) के बढ़ते 8 μl जोड़ें और ध्यान से एक 22 मिमी x 22 मिमी कवर पर्ची के साथ बढ़ते मीडिया उपरिशायी। Oocytes हवा के बुलबुले फँसाने और / या क्षति से बचाने के लिए धीरे-धीरे coverslip कम।
नोट: वैकल्पिक रूप से, confocal माइक्रोस्कोपी के विश्लेषण के लिए डिम्बाणुजनकोशिका के 3-आयामी गुणों को बनाए रखने से पहले स्लाइड पर बढ़ते करने के लिए कवर पर्ची के कोनों को 100 माइक्रोन कांच के मोती (पेट्रोलियम जेली के साथ मिश्रित) की एक छोटी मात्रा जोड़ने के लिए। - 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्लाइड, या अर्धसूत्रीविभाजनिक प्रगति के आकलन के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया माध्यमिक एंटीबॉडी मैच के लिए आवश्यक फिल्टर के साथ सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग अभिव्यक्ति के स्तर और subcellular प्रोटीन स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें।
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Representative Results
SiRNAs की microinjection इन विट्रो में अलग लक्ष्य कारकों के कुशल और अति विशिष्ट कार्यात्मक परीक्षण में सक्षम बनाता है जो oocytes में mRNA गिरावट और बाद में प्रोटीन की कमी, के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है। बाद में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस विशिष्ट फेनोटाइप विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है और साथ ही siRNA इंजेक्शन oocytes में प्रोटीन की कमी को मान्य करने के लिए। वर्तमान उदाहरण में, विरोधी ट्यूबिलिन और विरोधी pericentrin एंटीबॉडी के साथ एक साथ DAPI साथ व्यक्तिगत oocytes की फ्लोरोसेंट लेबलिंग सक्षम: के रूप में अच्छी तरह से pericentrin कमी (i) पुष्टिकरण (ii) के नियंत्रण में दोनों क्रोमेटिन और अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी विन्यास की एक व्यापक मूल्यांकन और PCNT - समाप्त oocytes।
गैर विशिष्ट नियंत्रण या Pcnt siRNAs साथ microinjected oocytes के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों। चित्रा 2 7 में दिखाया गया है एक 17 घंटा संस्कृति के बाद, सबसे अधिक नियंत्रण oocytes मेटाफ़ेज़-द्वितीय हिरन पहुंच गयाई और धुरी डंडे (2A चित्रा) पर गठबंधन क्रोमोसोम और उज्ज्वल pericentrin लेबलिंग के साथ अर्धसूत्रीविभाजनिक स्पिंडल संगठित होते हैं। विशेष रूप से, pericentrin इन कोशिकाओं में पछाड़ना कुशल प्रोटीन, पुष्टि Pcnt siRNA साथ इंजेक्शन oocytes में पता नहीं था। इसके अलावा, PCNT समाप्त oocytes के बहुमत metaphase-मैं मंच पर बने रहे और misaligned गुणसूत्रों (चित्रा 2 बी) के साथ बेतरतीब धुरी संरचनाओं दिखा रहे हैं। metaphase-द्वितीय के लिए आगे बढ़े कि कुछ PCNT समाप्त oocytes भी बाधित स्पिंडल (चित्रा -2) का प्रदर्शन किया।
चित्रा 2. माउस oocytes में अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी संगठन के immunofluorescence विश्लेषण या तो (ए) के साथ इंजेक्शन oocytes की छवियों प्रतिनिधि (बी, सी) विशिष्ट Pcnt साथ गैर विशिष्ट siRNAs या नियंत्रित करते हैं। -siRNAs। Oocytes डबल लेबल एक साथ सूक्ष्मनलिकाएं का पता लगाने (हरा) के लिए एक विरोधी Acetylated α ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के साथ विरोधी pericentrin (लाल) के साथ थे। डीएनए DAPI साथ चिह्नित किया गया है और नीले रंग में दिखाया गया है। इनसेट धुरी ध्रुव क्षेत्र के एक 2X बढ़ाई पता चलता है। तीर misaligned गुणसूत्रों निरूपित। * तकला पोल। पंजाब: पहले ध्रुवीय शरीर। 10 माइक्रोन के पैमाने पर पट्टी। यह आंकड़ा मा और Viveiros, 2014 7 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सभी अभिकर्मकों के सदस्य। लिस्टिंग की तैयारी और सदस्य के 250 मिलीलीटर तैयार करने की जरूरत विशिष्ट मात्रा के लिए तालिका 1. पकाने की विधि। मीडिया 7 दिन की एक अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 0.45 माइक्रोन सेलूलोज एसीटेट (सीए) झिल्ली फिल्टर यूनिट का उपयोग निष्फल और संग्रहीत फिल्टर है।
| रासायनिक | Amounटी |
| अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान (10x) | 25 मिलीलीटर |
| सोडियम बाइकार्बोनेट | 0.550 ग्राम |
| पाइरुविक तेजाब | 0.0063 जी |
| पेनिसिलीन जी | 0.0188 जी |
| स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट | 0.0125 जी |
| एल Glutamine | 0.073 ग्राम |
| EDTA, Disodium नमक Dihydrate | 0.1 मिलीग्राम |
| आवश्यक अमीनो एसिड (50x) | 5.0 मिलीलीटर |
| सदस्य विटामिन मिश्रण (100x) | 2.5 मिलीलीटर |
| फिनोल लाल समाधान | 0.2 मिलीलीटर |
| गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) | 0.75 ग्राम |
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Discussion
ऐसे electroporation और अभिकर्मक के रूप में दैहिक कोशिकाओं में बहिर्जात न्यूक्लिक एसिड हस्तांतरण के लिए कई तरीके हैं, वहीं microinjection transcriptionally मौन माउस oocytes में आरएनए अणुओं के वितरण के लिए इष्टतम तरीका है। मौजूदा प्रोटोकॉल अलग धुरी और / या oocytes में MTOC जुड़े कारकों के कार्यात्मक परीक्षण सक्षम है कि विशिष्ट mRNAs की इन विट्रो कमी के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण कुशल प्रतिलेख कमी में परिणाम और अत्यधिक अनुकूलनीय है। SiRNAs विशेष Pcnt टेप को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल होता था, इसी तरह की स्थिति ब्याज के लगभग किसी जीन को लक्षित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
डिम्बाणुजनकोशिका संग्रह, संस्कृति और हेरफेर सहित इस प्रोटोकॉल के कई पहलुओं, डिम्बाणुजनकोशिका गुणवत्ता बनाए रखने के लिए और तकनीकी कलाकृतियों से बचने के लिए अभ्यास और अनुभव की आवश्यकता होती है। संस्कृति मीडिया के पीएच और / या तापमान में उतार चढ़ाव काम कर ई से परहेज किया जाना चाहिएxpediently और ध्यान से। Oocytes के छोटे समूहों के microinjection, और हानिकारक तापमान परिवर्तन तक सीमित कर देगा microinjection प्रणाली में एक गर्म मंच की उपलब्धता। पूर्व मान्य siRNAs के उपयोग की सिफारिश की है और कुशल लक्ष्य प्रोटीन की कमी इम्यूनोफ्लोरेसेंस या पश्चिमी सोख्ता द्वारा पुष्टि की आवश्यकता है। कुछ कदम हित के विभिन्न जीनों को लक्षित करने के लिए संशोधन की आवश्यकता होगी। उदाहरण के लिए, की सिफारिश की 24 घंटा milrinone पूरक माध्यम में विभिन्न siRNAs के लिए प्रभावी है 'की अवधि पकड़'। हालांकि, इस समय अवधि के लिए विशेष रूप से लंबे समय तक आधा जीवन के साथ अत्यधिक प्रचुर मात्रा में mRNAs और / या लक्ष्य प्रोटीन के लिए समायोजन की आवश्यकता हो सकती है, या कम प्रचुर मात्रा में लक्ष्य के लिए छोटा किया जा सकता है। फिर भी, यह कि डिम्बाणुजनकोशिका गुणवत्ता और अर्धसूत्रीविभाजनिक संभावित सबसे अच्छा 24 घंटा या उससे कम की पकड़ समय का उपयोग संरक्षित कर रहे हैं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। डिम्बाणुजनकोशिका हैंडलिंग के साथ सावधानी भी निर्धारण और immunofluorescence विश्लेषण के दौरान की जरूरत है। 37 डिग्री सेल्सियस पर डिम्बाणुजनकोशिका निर्धारण सूक्ष्मनलिका depolymer की सीमाकम तापमान के साथ होता है, और जो बेहतर ization, अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी संरचना को बरकरार रखता है। हालांकि, इन शर्तों के हित के लक्ष्य प्रोटीन के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए इष्टतम स्थितियों (यानी, एंटीबॉडी सांद्रता के साथ ही ऊष्मायन समय और तापमान) भी हित के सभी एंटीबॉडी के लिए स्थापित किया है, और siRNA microinjection का आयोजन करने के लिए कड़ाई से पहले परीक्षण किया जा करने की जरूरत है।
डिम्बाणुजनकोशिका व्यवहार्यता केवल संस्कृति में एक सीमित समय के लिए निरंतर किया जा सकता के रूप में इस तकनीक को प्रभावी ढंग से, अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरना करने डिम्बाणुजनकोशिका गुणवत्ता और क्षमता का कहना है कि एक उचित समय सीमा के भीतर अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन और गिरेगा नहीं हो सकता है। Hypomorph phenotypes के लक्ष्य टेप की आंशिक पछाड़ना के साथ मनाया जा सकता है। हालांकि, विशिष्ट morpholinos सह इंजेक्शन अनुवाद के अतिरिक्त निषेध के लिए एक समानांतर रणनीति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। कुछ सीमाओं के संभावित बहाव के ANALY के रूप में भी कर रहे हैंmicroinjected oocytes के साथ संभव है कि बहन। उदाहरण के लिए, आवश्यक हैंडलिंग और बढ़ाया संस्कृति सफल इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आईवीएफ) से गुजरना और पूर्व आरोपण भ्रूण विकास पर कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन रोकता करने डिम्बाणुजनकोशिका क्षमता को सीमित कर सकते हैं। इसके अलावा, बड़े आकार के नमूनों में इस तरह के immunoblotting या जैव रासायनिक assays के रूप में कुछ नीचे की ओर अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हैं कि इस दृष्टिकोण के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो जाता है।
कुछ सीमाओं के बावजूद, इस दृष्टिकोण oocytes में विभिन्न कारकों में से कार्यात्मक परीक्षण के लिए सक्षम बनाता है और विभिन्न अनुसंधान समूहों द्वारा सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है कि विशिष्ट mRNAs का विट्रो रिक्तीकरण में प्रभावी बढ़ावा देता है। Oocytes में नुकसान के समारोह विश्लेषण आमतौर पर (सशर्त) पीटकर या ट्रांसजेनिक आरएनएआई माउस मॉडल की पीढ़ी शामिल है। दोनों दृष्टिकोण श्रम और समय लेने वाला है। इसके विपरीत, इन विट्रो में siRNA microinjection आसानी से काफी के साथ कार्यात्मक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकताकम समय और संसाधनों। यह एक पीटा / ट्रांसजेनिक माउस मॉडल पैदा करने के काम पर तैयार कर पहले एक लक्ष्य प्रोटीन के कार्यात्मक प्रभाव की जानकारी हासिल करने के लिए एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है।
siRNA microinjection और immunofluorescence विश्लेषण के संयोजन siRNA की मध्यस्थता लक्ष्य प्रोटीन की कमी के जवाब में अर्धसूत्रीविभाजनिक प्रगति के विभिन्न चरणों के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति और subcellular वितरण पैटर्न के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण प्रदान करता है। डिम्बाणुजनकोशिका से डिम्बाणुजनकोशिका को siRNA प्रभावकारिता में संभावित मतभेद आसानी से पहचाने हैं और सफल लक्ष्य प्रोटीन की कमी और phenotypical / कार्यात्मक विश्लेषण के बीच सटीक सहसंबंध के लिए अनुमति देते हैं। हिस्टोन H2B-GFP संलयन प्रोटीन (या अन्य fluorescently लेबल मार्कर) एन्कोडिंग छाया हुआ मैसेंजर आरएनए के साथ विशिष्ट siRNA अणुओं के सह इंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल के आगे विकास को लाइव सेल द्वारा वास्तविक समय में लक्ष्य प्रोटीन समारोह के आकलन के लिए सक्षम हो जाएगाएल इमेजिंग।
सारांश में, अनुकूलित शर्तों के साथ प्रतिलेख मुंह बंद करने के लिए siRNA microinjection ऐसे immunofluorescence विश्लेषण के रूप में अन्य शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरणों के साथ संयुक्त है, खासकर जब सेल के आधार पर प्रति एक सेल, पर माउस oocytes में विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन के समारोह का परीक्षण करने के लिए एक मूल्यवान यंत्रवत दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस संयुक्त दृष्टिकोण सफलतापूर्वक MTOC जुड़े प्रोटीन और गिरेगा और अर्धसूत्रीविभाजनिक धुरी गठन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
References
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