L'uso di un multi-comparto dinamico singolo enzima Phantom per gli Studi di hyperpolarized Risonanza Magnetica Agents

Sommario

Un fantoccio dinamico multi-compartimento viene utilizzato per simulare alcune biologie di interesse per studi metabolici utilizzando agenti di risonanza magnetica iperpolarizzata.

Abstract

Imaging di substrati hyperpolarized di risonanza magnetica mostra una grande promessa per la valutazione clinica dei processi biochimici critici in tempo reale. A causa di vincoli fondamentali imposti dallo Stato iperpolarizzato, tecniche di imaging e di ricostruzione esotiche sono comunemente usati. è criticamente necessario un sistema pratico per la caratterizzazione delle dinamiche, metodi di imaging multi-spettrale. Tale sistema deve riproducibile ricapitolare le dinamiche chimici utili dei tessuti normali e patologici. Il substrato più ampiamente utilizzato fino ad oggi è hyperpolarized [1- ¹³ C] -pyruvate per la valutazione del metabolismo del cancro. Descriviamo un sistema phantom a base di enzimi che media la conversione del piruvato in lattato. La reazione viene iniziata mediante iniezione dell'agente iperpolarizzato in più sezioni nell'ambito del fantoccio, ciascuno dei quali contiene diverse concentrazioni di reagenti che controllano la velocità di reazione. Più compartimenti sono necessarie per garantire che imasequenze ging catturano fedelmente l'eterogeneità spaziale e metaboliche del tessuto. Questo sistema sarà di aiuto allo sviluppo e la convalida di strategie di imaging avanzate, fornendo dinamiche chimiche che non sono disponibili da fantasmi convenzionali, così come il controllo e la riproducibilità ciò non è possibile in vivo.

Introduzione

L'impatto clinico della risonanza magnetica iperpolarizzato (MRI) di ¹³ composti C-marcati è criticamente dipendente dalla sua capacità di misurare i tassi di conversione chimica nel tempo reale spettroscopia di risonanza magnetica e spettroscopia di imaging ^1-5. Durante lo sviluppo sequenza e la verifica, conversione chimica dinamica viene generalmente ottenuta attraverso in vivo o in vitro ^6-9 che offrono un controllo limitato e riproducibilità. Per il test robusto e la garanzia della qualità, un sistema più controllato che conserva la conversione chimica endemica a questa misura sarebbe preferibile. Descriviamo un metodo per realizzare questa conversione in modo riproducibile utilizzando un singolo dinamica phantom enzima.

La maggior parte degli studi con hyperpolarized ¹³ agenti C Focus on Imaging substrati hyperpolarized in un ambiente biologico funzionante. Questa è la scelta più ovvia se l'obiettivo è quello di studiare biologicaAl trattate o determinare un potenziale di impatto sulla cura clinica. Tuttavia, se la caratterizzazione di qualche algoritmo di elaborazione del sistema di misura o di dati è desiderato, modelli biologici presentano numerosi inconvenienti quali intrinseca variabilità spaziale e temporale ^10. Tuttavia, fantasmi statiche convenzionali hanno la conversione chimica che guida l'interesse clinico primario in MRI di substrati hyperpolarized, e non possono essere utilizzati per caratterizzare rilevamento di tassi di conversione o altri parametri dinamici ^11. Utilizzando un unico sistema enzimatico possiamo fornire conversione chimica controllabili e riproducibili, consentendo rigoroso esame delle strategie di imaging dinamico.

Questo sistema è rivolto ai ricercatori che stanno sviluppando strategie di imaging per substrati hyperpolarized e desiderano caratterizzare le prestazioni per il confronto con approcci alternativi. Se le misurazioni statiche sono il punto finale desiderato quindi statico ¹³ C-etichettati metabolita fantasmi will bastare ^11. Sull'altra estremità se più caratterizzazione biologico complesso è fondamentale per il metodo (consegna, densità cellulare, ecc), allora saranno necessari modelli biologici effettive ^12-14. Questo sistema è ideale per la valutazione delle strategie di imaging che mirano a fornire una misura quantitativa dei tassi di conversione chimica apparenti.

Protocollo

NOTA: (Phantom Design) Due 3 ml camere sono state ricavate da Ultem e dotati di tubi in PEEK (1,5875 millimetri OD e 0,762 millimetri ID) per l'iniezione e di scarico. Le sezioni sono state poste in una provetta da centrifuga da 50 ml riempito con acqua (Figura 1). Per evitare vuoti di segnale creati da bolle, le camere e le linee sono stati pre riempiti con acqua deionizzata (DH ₂ O).

1. Soluzione Preparazione

1. Preparare 1 soluzione tampone L (81,3 mM Tris pH 7,6, 203,3 mM NaCl). Pesare 11.38 cristalli preimpostati g Trizma pH 7,6 e 11,88 g di NaCl e sciogliere in 1 L di dH ₂ O.
2. Preparare 50 mM soluzione NADH. Pesare 17,8 mg di sale dipotassico β-nicotinammide adenina dinucleotide (NADH), ridotta e sciogliere in 280 ml di soluzione tampone che è stato preparato al punto uno.
3. Preparare 250 soluzione U / ml enzimatica. Pesare 78.75 unità di attività di lattato deidrogenasi (LDH) e sciogliere in 315 microlitri di buffer da sTep uno.
4. Preparare mix acido piruvico. Pesare 21,4 mg Ox063 trityl radicale e sciogliere in 1,26 g (~ 1 ml) [1- ¹³ C] acido piruvico.
5. Preparare supporti scioglimento (40 mM Tris pH 7,6, 40 mM NaOH, 0,27 mm e 50 mm EDTA NaCl). Pesare 5,96 g di cristalli Trizma preimpostati pH 7,6, 1,6 g di NaOH, 0,1 g di acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA) e 2,9 g di NaCl e sciogliere in 1 L dH ₂ O.
6. Preparare 01:10 soluzione Gadoteridolo (50 mm). Mescolare 1 ml di gadoteridolo in 9 ml di dH ₂ O. Preparazione 8 M ^[13 C] urea. Pesare 1.465 5 urea ^[13 C] e sciogliere in 3 ml di dH ₂ O.

2. Preparazione di hyperpolarized piruvato

1. In una tazza di esempio per un sistema dinamico di polarizzazione nucleare (DNP), pipettare 0,3 ml di soluzione di Gadoteridolo e 13 mg (~ 10 microlitri) della soluzione di acido piruvico.
2. Brevemente mescolare questa miscela in tazza campione con la punta della pipetta.
3. Inserire campione nel sistema DNP.
   1. Assicurarsi che la porta al sistema di DNP è chiuso. Iniziare il processo di inserimento del campione facendo clic sul pulsante del campione inserto sulla console del sistema DNP. Sulla procedura guidata di esempio selezionare campione normale e premere Avanti.
   2. Mantenere la coppa campioni verticale collocare delicatamente l'asta di inserimento sopra la parte superiore della coppa campione. Quando richiesto, aprire il sistema DNP e inserire la coppa nell'inserto a temperatura variabile (VTI) utilizzando l'asta di inserimento.
   3. Tirare lo stantuffo al termine della asta di inserimento del campione per rilasciare il campione nell'indice a temperatura variabile. Rimuovere l'asta di inserimento del campione dal sistema e fare clic sul pulsante Avanti sulla console del sistema DNP.
4. Avviare la polarizzazione.
   1. Fare clic sul pulsante di avvio di polarizzazione sulla console del sistema DNP. Nel RINMR tipo di software .HYPERSENSENMR per lanciare la polarizzazione software di monitoraggio. Impostare costruire la configurazione a 1 e premere Invio. Quindi scegliere Genera solido up.
   2. Impostare il percorso e il nome del file di salvataggio. Selezionare il profilo per il 13-C nella goccia scheda sulla console del sistema DNP verso il basso e fare clic su Avanti. Selezionare la casella di assaggiare durante l'accumulo, impostare il tempo di campionamento di 300 sec e fare clic su Fine.
5. Misurare 3,85 g (~ 4 ml) dei mezzi di dissoluzione sia in volume con una siringa da 5 ml o in peso utilizzando una scala.

3. Preparazione del Enzyme Fantasma

1. Riempire una provetta con ~ 3 ml ^[13 C] soluzione di urea e posizionarlo nella provetta da centrifuga da 50 ml. Riempire la provetta da centrifuga da 50 ml con dH ₂ O.
2. Pre-riempire le due camere enzimatici e le linee con dH ₂ O iniettando ~ 3 ml di dH ₂ O nelle linee d'iniezione del fantoccio, avendo cura di svuotare eventuali bolle formate.
3. Posizionare il fantasma nel centro del magnete con facile accesso alle linee di iniezione. Assicurarsi che ci sia qualche contenitore per catturare il liquido che sfogare a t egli linea di scarico.
4. Preparare la miscela di enzimi ad alta attività (17.14 mM NADH, 44.57 U / ml LDH). Mescolare 240 ml soluzione di NADH, soluzione LDH 125 ml e 335 ml di buffer e mantenere in una siringa da 3 ml che può essere collegato alla linea di iniezione.
   NOTA: Una volta unito con 500 ml di 40 mM di piruvato dal sistema DNP, il volume phantom finale sarà 1,2 ml con concentrazioni di 16,7 mM piruvato, 10 mM NADH e 26 U / L LDH in una soluzione tris tamponata a pH ~ 7.5.
5. Preparare la miscela attività enzimatica basso (17.14 mM NADH 26.79 U / ml LDH) Mescolare 240 ml soluzione di NADH, soluzione LDH 75 ml e 385 ml di buffer e conservare in un separato siringa da 3 ml che può essere collegato alla linea di iniezione.
   NOTA: Una volta unito con 500 ml di 40 mM di piruvato dal sistema DNP volume phantom finale sarà 1,2 ml con concentrazioni di 16,7 mM piruvato, 10 mM NADH e 15.625 U / L LDH in una soluzione tris tamponata a pH ~ 7,5 .

jove_title "> 4. eseguire qualsiasi Quality Assurance (QA) e di posizionamento Scansioni

1. posizionamento iniziale.
   1. Caricare una nuova scansione posizionamento FLASH in modalità di funzionamento ^[1 H] modalità Volume TX / RX. Cambiare impostare le dimensioni a 2: spettrometro Strumento di controllo -> Modifica GS -> Impostazione Dimensioni -> 2. Premere GSP sul controllo Spectrometer e spostare fantasma fino al centro del magnete. Premere STOP quindi premere GOP sul controllo Spectrometer.
2. Scan pilota.
   1. Caricare una nuova scansione posizionamento TriPiolt in modalità di funzionamento ^[1 H] modalità Volume TX / RX. Posizione Slice: Scan Control -> fetta Tool-> spostare fette (tenere premuto M chiave clic e trascinare, selezionare fetta di muoversi con il cursore pacchetto di fetta).
   2. Wobble ¹ H Coil: Strumento di controllo Spectrometer -> Acq -> Wobble. Tune and match ¹ H serpentina dietro il magnete e premere STOP. Tenendo premuto il tasto Shift premere il semaforo sulla finestra di controllo di scansione.

5. Setup radiale Echo Planar Spectral Imaging Scan

1. Caricare un eco planare di imaging spettroscopico nuovo radiale (radEPSI) scansione in modalità di funzionamento ^[13 C] TX / RX modalità Volume. Posizione Slice: strumento sezione sul controllo di scansione e spostare fette (tenere M chiave clic e trascinare, selezionare fetta di muoversi con il cursore pacchetto di fetta).
2. Wobble ¹³ C Coil cliccando Spectrometer Strumento di controllo -> Acq -> Wobble. Impostare il guadagno del ricevitore per 1.000-2.000 sul Spectrometer.
3. Eseguire il controllo del sistema finale. Seconda della sequenza, osservare carbonio 13 segnale dalla camera di urea in un protocollo esploratore.
   NOTA: Questo assicura che il sistema sia configurato correttamente prima di iniziare il processo di dissoluzione irreversibile.

6. Eseguire Scioglimento

1. Quando il piruvato ha raggiunto> 90% di polarizzazione (~ 1 ora), le soluzioni e le fantasma sono pronti, e la scansione viene configurato clic sul pulsante Esegui dissoluzione sul sy DNParginare console.
2. Quando richiesto spostare il bastone di dissoluzione nella sua posizione di lavoro e iniettare mezzi di dissoluzione. Chiudere il sistema DNP e fare clic sul pulsante finito sulla console del sistema DNP. Spostare bastone dissoluzione nella posizione di riposo quando viene richiesto quindi fare clic su Fine.
3. Quando il sistema DNP batte il piruvato iperpolarizzato (~ 2 min dopo l'inizio del riscaldamento) ritirare 500 microlitri della soluzione di piruvato in ciascuna delle siringhe soluzione di alta e bassa concentrazione dell'enzima. Lentamente (~ 10 sec) iniettare ogni siringa in una linea di iniezione.
   NOTA: La scansione potrebbe essere stato avviato prima dell'iniezione o in qualsiasi momento fino a dopo l'iniezione 3 min a seconda del protocollo di scansione utilizzato.

Processing 7. Immagine

NOTA: Questo fantasma è stato progettato per essere utilizzato con molte strategie di imaging. Vedere Figura 2, come un esempio di come le immagini rad-EPSI stati trattati con Matlab.

1. Caricare i dati grezzi dal file FID. Reshape i dati in base al numero di proiezioni, lettura punti, echi e considerazione per i dati memorizzati come coppie reali e immaginari. Separare i punti eco pari e dispari.
2. Fourier entrambi gli echi pari o dispari lungo le dimensioni eco. Visivamente individuare le bande di frequenza per piruvato e lattato. Per semplicità è stato utilizzato il valore assoluto dello spettro.
3. Separare ogni banda metabolita e trasformata di Fourier lungo la direzione di codifica di frequenza per produrre sinograms isolati per ogni metabolita. radon trasformazione inversa le sinograms separati per produrre l'immagine di una lattato o piruvato.

Risultati

immagini 2D Slice-selettivi sono state acquisite utilizzando una sequenza di istantanee radEPSI. immagini metabolita sono state ricostruite utilizzando di nuovo filtrato proiezione. Le immagini metabolita erano ben allineati con immagini di protoni, come visibile in figura 2. In questo sistema iperpolarizzato segnale lattato può essere generata solo dalla conversione enzimatica di piruvato iperpolarizzato. In figura 4, la camera inferiore, con concentraz...

Discussione

l'imaging in tempo reale di metaboliti hyperpolarized ha molte sfide uniche per la progettazione sequenza, convalida e controllo qualità. La capacità di risolvere l'eterogeneità spazio-temporale e spettrale offre un notevole potenziale clinico, ma preclude QA e validazione metodi associati con la RM convenzionale. sequenze di immagini complesse o algoritmi di ricostruzione possono avere dipendenze sottili che li rendono difficili da caratterizzare o convalidare al di fuori di questo esperimento di imaging. L'...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 Tesla Scanner MRI preclinico
HyperSense	Oxford Instruments	Polarizzatore nucleare dinamico Hypersense DNP Polarizzatore	nucleare dinamico per agenti MRI
1-13C-Acido piruvico	Sigma Aldrich	677175	Carbonio 13 labled acido piruvico puro
Trityl Radical	GE Healthcare	OX063	Radicale libero utilizzato nella polarizzazione nucleare dinamica
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Acido etilendiamminotetraacetico
LDH	Worthingthon	LS002755	Lattato Deidrogenasi dal muscolo di coniglio
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-Nicotinamide adenina dinucleotide, sale dipotassico ridotto
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma Cristalli preimpostati
NaCl	Sigma Aldrich	S7653