Utilisation Tomoauto: Un protocole pour la tomographie à haut débit automatisé cryo-électronique
Summary
Nous présentons un protocole sur la façon d'utiliser à haut débit tomographie cryo-électronique pour déterminer haute résolution dans les structures in situ de machines moléculaires. Le protocole permet de grandes quantités de données à traiter, évite les goulots d'étranglement communs et de réduire l'indisponibilité des ressources, permettant à l'utilisateur de se concentrer sur des questions biologiques importantes.
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
III systèmes de sécrétion de type (T3SS) sont des déterminants de virulence essentiels pour de nombreux agents pathogènes Gram-négatifs. Le injectisome, également connu sous le complexe d'aiguille, est la machine de SST3 central nécessaire pour la translocation directe de protéines effectrices de la bactérie dans des cellules hôtes eucaryotes 1, 2. L'injectisome comprend une aiguille extracellulaire, un corps de base, et un complexe cytoplasmique également connue comme le complexe de tri 3. Des études antérieures ont permis d'élucider les structures 3-D de injectisomes purifiés de Salmonella et Shigella, ainsi que les structures atomiques de protéines majeures basale du corps 4, 5. Récente dans les structures in situ de injectisomes de Salmonella, Shigella, et Yersinia ont été révélés par cryo-ET 6 , 7. Cependant, le complexe cytoplasmique, essentielle pour la sélection d'effecteur et ensemble d'aiguille, n'a pas été visualisées dans ces structures.
Cryo-ET est le most technique convenable pour l'imagerie de machinerie moléculaire à une résolution nanométrique dans son contexte natif cellulaire (in situ). Néanmoins, la résolution obtenue par cryo-ET est limitée par l'épaisseur de l'échantillon. Pour pallier l'inconvénient, nous imagé injectisomes intactes dans une souche de Shigella flexneri virulente qui a été génétiquement modifié pour produire minicellules suffisamment minces pour la cryo-ET. Une autre limitation de cryo-ET est la sensibilité de l'échantillon au rayonnement induit par le faisceau d'électrons, qui détruit très rapidement l'information à haute résolution dans l'échantillon. En conséquence, des doses extrêmement faibles sont utilisés pour le basculement-images individuelles de telle sorte qu'une dose appropriée peut être répartie entre l'inclinaison de la série complète. Cela réduit considérablement le rapport signal sur bruit (SNR) dans la reconstruction finale, ce qui rend difficile de différencier les caractéristiques structurelles de l'objet à partir de la grande quantité de bruit dans le tomogramme et limite la résolution qui peut être obtenue par cryo- ET. Conventitraitement de l'image d'Onal comme Fourier et filtres-espace réel comme à la baisse échantillonnage peut être utilisé pour augmenter le contraste, mais au détriment de filtrer la plupart des informations à haute résolution. Récemment, la sous-tomogramme moyenne a permis d'augmenter considérablement le SNR et ensuite la résolution finale dans certains cas à des niveaux sub-nanométriques 8, 9. Une analyse plus détaillée de complexes est rendue possible par l'extraction de calculs des milliers de sous-tomogrammes contenant les zones d'intérêt à partir des tomographies d'origine, puis l'alignement et la moyenne de la sous-tomogrammes pour déterminer in situ dans des structures complexes avec SNR plus élevé et de plus haute résolution. Ces méthodes peuvent être intégrées à des approches génétiques pour fournir encore plus de connaissances dans des assemblages macromoléculaires et leurs conformations dynamiques dans le contexte cellulaire natif.
En général, des dizaines, voire des centaines de milliers de sous-tomographies doivent être en moyenne afin de déterminer haute-Résolution structures in situ. L'acquisition d'un nombre suffisant d'inclinaison série nécessaire pour produire ce grand nombre de sous-tomographies devient rapidement un goulot d'étranglement. L'inclinaison de la série résultant sont souvent affectée par le déplacement induit par faisceau, jeu de scène, ainsi que l'agrandissement, rotation et inclinaison défauts, qui doit être résolu à apporter le tilt-série dans l'alignement avant la reconstruction. La série d'inclinaison est généralement aligné par Repérage or marqueurs de référence, qui sont traditionnellement choisis manuellement par l'inspection de l'inclinaison de la série, ce qui provoque encore un autre goulot d'étranglement. De nombreux logiciels ont été développés pour l'acquisition d'inclinaison série automatisé grâce à des microscopes électroniques contrôlés par l'ordinateur 10, 11, 12, l'alignement tilt-série et de la reconstruction 13, 14 et sous-tomogramme moyenne 15-18. Comme ces paquets effectuer des opérations discrètes dans le workflow de cryo-ET, il devient souhaitable de construire un niveau d'abstraction plus élevé dans le processus de systemaquement de rationaliser l'ensemble du régime en un seul pipeline. Par conséquent, nous avons développé une bibliothèque de wrapper du logiciel "tomoauto" conçu pour organiser un certain nombre de ces paquets dans une unité semi-automatisé unique, permettant un fonctionnement utilisateur simple tout en conservant la configuration complète de chaque composant de manière centralisée. La bibliothèque est open-source, bien documenté, continuellement développé et librement disponible pour l'utilisation, le développement sur mesure ou une intégration plus au moyen d'un code source distante dépôt en ligne (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Ce haut-débit cryo-ET pipeline a été utilisée pour visualiser injectisomes intactes en S. minicellules flexneri. Un total de 1,917 tomographies ont été générés en utilisant cette méthode, révélant une haute résolution de la structure in situ de la machine intact, y compris la plate-forme de tri cytoplasmique déterminé par sous-tomogramme moyenne de 19. Avec la modélisation moléculaire de type sauvage et mutant machines, notre pipeline à haut débit offre une nouvelle voie pour comprendre la structure et la fonction du injectisome intacte dans le contexte cellulaire natif.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode à haut débit décrit ici nous a permis de traiter 1917 cryo tilt-série et de produire plus de 4500 sous-tomographies de la intacts S. flexneri injectisome 19. Les données recueillies ont abouti à la caractérisation détaillée de injectisome in situ, y compris le tri complexe cytoplasmique. Le procédé a également été utilisé pour visualiser plusieurs cellules mutantes avec deletion spécifique de composants protéiques putatifs, ce qui a permis d'élucide…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr William Margolin pour commentaires. Nous sommes reconnaissants pour le soutien sur SerialEM de Drs. David Chen Xu et Mastronarde. DM, BH et JL ont été soutenus par Grant R01AI087946 de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses, des subventions et R01GM110243 R01GM107629 de l'Institut national des sciences médicales générales (NIGMS), et Grant UA-1 714 de la Fondation Welch. Le détecteur d'électrons direct a été financée par les Instituts nationaux de la santé S10OD016279 Award.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
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