تحسين 2D و 3D الجلد في المختبر نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام

Paula Benny; Cedric Badowski; E. Birgitte Lane; Michael Raghunath

doi:10.3791/53642

Method Article

تحسين 2D و 3D الجلد في المختبر نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام

DOI:

10.3791/53642

⸱

August 22nd, 2016

Paula Benny¹^,² , Cedric Badowski² , E. Birgitte Lane² , Michael Raghunath¹^,²^,³

¹Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, ²Epithelial Biology Laboratory, Institute of Medical Biology, A*STAR, ³Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكول للحصول على المصفوفات المشتقة من خلية غنية في البروتينات المصفوفة خارج الخلية، وذلك باستخدام crowders الجزيئات (MMC). وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم البروتوكول الذي يتضمن MMC في 3D عضوي النمط الجيل الجلد ثقافة مشتركة، مما يقلل من الوقت الثقافة مع المحافظة على استحقاق بناء.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأسرة بروتين سكري من الكولاجين تمثل البروتينات الهيكلية الرئيسية في جسم الإنسان، وهي المكونات الرئيسية من المواد الحيوية المستخدمة في هندسة الأنسجة الحديثة. وعنق الزجاجة الفني هو ترسب الكولاجين في المختبر، كما أنها بطيئة بشكل ملاحظ، مما أدى إلى تشكيل دون المستوى الأمثل من النسيج الضام، وتماسك النسيج لاحقا، ولا سيما في نماذج الجلد. هنا، نحن تصف الطريقة التي يتضمن إضافة تفاضلي الحجم السكروز شارك في البوليمرات على الثقافات الجلد لتوليد الجزيئات الازدحام (MMC)، مما يؤدي إلى تعزيز مثيرة من ترسب الكولاجين. بشكل خاص، أودعت الخلايا الليفية الجلدية كمية كبيرة من الكولاجين I / الرابع / السابع والفيبرونكتين تحت MMC بالمقارنة مع مجموعة المقارنة.

يصف بروتوكول أيضا وسيلة لdecellularize طبقات الخلايا المزدحمة، وتعريض كميات كبيرة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي تم الإبقاء على سطح الثقافة كما يتضح من immunocytochemistry. تمت دراسة مجمل الكتلة المصفوفة وتوزيع نمط استخدام التدخل انعكاس المجهر. ومن المثير للاهتمام، الخلايا الليفية، الخلايا الكيراتينية وشارك في الثقافات أنتجت المصفوفات المشتقة من خلية (CDM) متفاوتة تكوين والتشكل. آلية التنمية النظيفة يمكن استخدامها باسم "السقالات الحيوي" بذر خلية الثانوي، حيث الاستخدام الحالي من الطلاء أو السقالات، وعادة من مصادر حيوانية xenogenic، يمكن تجنبها، وبالتالي التحرك نحو المزيد من التطبيقات ذات الصلة سريريا.

وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول تطبيق MMC خلال المرحلة المغمور من الجلد نموذج 3D عضوي النمط الثقافة المشتركة التي كانت كافية لتعزيز ECM ترسب في الوصل البشروي الأدمي (DEJ)، على وجه الخصوص، والكولاجين السابع، المكون الرئيسي رسو الألياف. أكد الإلكترون المجهري وجود ترسيخ الألياف في الثقافات المتقدمة مع MMC، مقارنة بمجموعة التحكم. وهذا أمر مهم كما الألياف ترسيخ حبل الأدمة إلى البشرة، وبالتالي،وجود شكل ما قبل النضج DEJ قد يستفيد المتلقين الكسب غير المشروع الجلد من حيث الاستقرار الكسب غير المشروع والتئام الجروح بشكل عام. وعلاوة على ذلك، تم تكثيفه الوقت ثقافة من 5 أسابيع إلى 3 أسابيع للحصول على بناء ناضجة، عند استخدام الوسائط المتعددة، وخفض التكاليف.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكل الجلد حاجزا واقيا عن طريق منع فقدان الماء ودخول العوامل المسببة للأمراض. وهي مكونة من ثلاثة عناصر رئيسية هي؛ وانسجة الأدمة غنية ^1، البشرة طبقية ^2،3،4 على أعلى من ذلك، والوصل البشروي الأدمي بين ^5،6. وتتكون الأدمة إلى حد كبير من الكولاجين والألياف المرنة وذات كثافة سكانية منخفضة مع الخلايا الليفية ^7. في المقابل، وتتكون البشرة خلايا غنية من طبقات متعددة من الخلايا الكيراتينية. الخلايا الكيراتينية من الطبقة الداخلية الأكثر هي التكاثري وتوفر الخلايا القاعدية الجديدة التي تجديد واستبدال الخلايا الكيراتينية التفريق عضال التي تتحرك باستمرار إلى الخارجية، حيث ان معظم طبقة من الجلد وفقدت ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الجزيئات الازدحام في 2D الثقافات الجلد خلية

البذور 50000 الخلايا (الخلايا الليفية الأولية أو الخلايا الكيراتينية الأولية أو ثقافة مشتركة من الخلايا الليفية والخلايا الكيراتينية الأولية) لكل بئر من 24 لوحة جيدا. خلايا البذور في 1 مل من وسائل الاعلام نمو نوع من الخلايا المقابلة.
السماح للخلايا الالتزام بين عشية وضحاها، في مئوية الحاضنة 37 درجة في 5٪ CO _2.
تجاهل وسائل الإعلام القديمة واستبدالها مع 1 مل وسائل الإعلام الجديدة التي ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان الزحام الجزيئات قادرة على تعزيز ECM الترسيب، وعلى وجه الخصوص، الخلايا الليفية أودعت المزيد من الكولاجين الأول والرابع والفيبرونكتين مقارنة للسيطرة على الثقافات (الشكل 1، طبقة الخليوي، 1A، والكولاجين الأول؛ 1B، الكولاجين الرابع؛ 1C، فبرونيكتين). على decellularization، كان واضحا أن الخلايا الليفية كانت المودعين الرئيسي الكولاجين الأول والرابع والفيبرونكتين بالمقارنة مع الخلايا ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم الحصول على مصفوفة محسنة خارج الخلية عند إدخال الحشود الجزيئية الكبيرة إلى زراعة الخلايا ، بسبب تأثير الحجم المستبعد الذي يزيد من انقسام بروببتيد بواسطة البروتينات. ينتج عن هذا معالجة المصفوفة خارج الخلية ، وخاصة الكولاجين ، بشكل أسرع وترسيب على سطح المزرعة. بينما حصلت مجموعات أخرى على طبقات سميكة من الخلايا الليفية ، فقد تضمنت وقت استزراع لعدة أسابيع²⁰. في المقابل ، فإن MMC الموصوف في هذا البروتوكول ، يقصر بشكل كبير من وقت الاستزراع مع زيادة كمية ECM. كما تم الإبلاغ عن زيادة معدلات التفاعل في مزارع الخلايا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ مصالح متضاربة للإفصاح عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية الحيوية ، سنغافورة من خلال الدعم الأساسي لمعهد البيولوجيا الطبية ومنحة SPF2013/005. تم دعم M.R. من خلال منحة لجنة أبحاث أعضاء هيئة التدريس NUS (الهندسة في الطب) (M.R.) R-397-000-081-112 ، وبرنامج NUS لهندسة الأنسجة (NUSTEP). يود المؤلفون أن يشكروا البروفيسور إيرين لي على توفير الجسم المضاد للكولاجين السابع. تم تنفيذ أعمال المجهر الإلكتروني في وحدة المجهر الإلكتروني بجامعة سنغافورة الوطنية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
حمض الأسكوربيك	واكو	013-12061	مادة مضافة لوسائط زراعة الخلايا
إدراج ثقافة الخلية (تنسيق 6 آبار)	Greiner Bio-One	657610	مزارع النمط العضوي
محلول السترات	Dako	S2369	DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate ، درجة الحموضة 6 (x10)
الكولاجين (ذيل الفئران)	Corning	354236	الثقافات العضوية
CnT-57	CELLnTEC	CnT-57	زراعة الخلايا
DAB الركيزة + مجموعة الكروموجين	Dako	K3468	Histology
لوحة البئر العميقة (تنسيق 6 آبار)	كورنينج	355467	ثقافات النمط العضوي
كاشف الكشف عن ECL كاشف الكشف عن ECL	GE Healthcare Life	Sciences RPN2106	Amersham ECL Western Blotting Detection
Reagent المجهر الإلكتروني (TEM)	؛ JEOL	JEM-1010 (100 كيلو فولت)	الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال
وسائط الخلايا الليفية (FM) نسبة			عالية من الجلوكوز DMEM + 10٪ مصل الأبقار الجنينية + 1٪ بنسلين ستربتومايسين
فيكول PM70	GE علوم الحياة للرعاية	17-0310-05	حشد الجزيئات
Ficoll PM400	GE علوم الحياة للرعاية	17-0300-05	مزاحم الجزيئات
الكبيرة وسائط خالية من مصل الخلايا الكيراتينية (KSFM)	Life Technologies	17005-042	وسائط زراعة الخلايا
المخزن المؤقت للتحلل	ThermoFisher Scientific	89900	عازلة التحلل لاستخراج البروتين. تمت إضافة مثبط البروتياز (Roche، #11836170001) إلى هذا التحلل المؤقت.
مجهر	Zeiss	LSM510	قنوات حمراء وخضراء وزرقاء لتصور البقع المناعية الفلورية AF594 و AF488 و DAPI (40X mag).
وسائط التركيب (Hydromount)	التشخيص الوطني	HS-106	وسائط تركيب تلطيخ الفلورسنت
(Cytoseal)	ThermoFisher Scientific	8310-16	علم الأنسجة (HRP)
مركب OCT (Tissue Tek)	Sakura	4583	التضمين لبضع
المضادات الحيوية البنسلين الستربتومايسين	Sigma Aldrich	A5955	لوسائط زراعة
المضاد للكولاجين I الأجسام المضادة	Abcam	#ab6308
المضادة للكولاجين من النوع الرابع	Novocastra	#NCL-COLL-IV
Anti-collagen VII			LH7.2 (في المنزل)
الأجسام المضادة المضادة للفيبرونكتين	Abcam	#ab2413
عامل اختزال	ThermoFisher Scientific	NP0009	اللطخة الغربية
عينة عازلة	ThermoFisher Scientific	NP0008	اللطخة
<قوية>الأجسام المضادة الثانوية (Immunostaining) < / strong>
4 & prime;، 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma Aldrich	#D9542
AlexaFluor 594 ThermoFisher الماعز المضاد للأرانب	علمي	#A-11037
AlexaFluor 594 الماعز المضاد للفأر	ThermoFisher Scientific	#A-11005
AlexaFluor 488 الدجاج المضاد للأرانب	ThermoFisher Scientific	#A-21441
AlexaFluor 488 الماعز المضاد للفأر	ThermoFisher Scientific	#A-11001
الأجسام المضادة الثانوية (HRP)	Dako	Envision + System - HRP Label Polymer المضاد للأرانب ومكافحة الفأر	غير مخفف
ديوكسيكولات الصوديوم	Prodotti Chimicie Alimentari		Decellularization
الوسائط الطبقية < / strong>
Dulbecco's Modified Eagle's Medium			تستخدم أثناء واجهة الهواء والسائل للثقافات العضوية. تتم إضافة هذه الوسائط إلى الجزء الخارجي من إدراج مزرعة الخلية.
لحم الخنزير s F12			تستخدم أثناء واجهة الهواء والسائل للثقافات العضوية. تتم إضافة هذه الوسائط إلى الجزء الخارجي من إدراج مزرعة الخلية.
10٪ مصل الأبقار الجنينية			تستخدم أثناء واجهة الهواء والسائل للثقافات العضوية. تتم إضافة هذه الوسائط إلى الجزء الخارجي من إدراج مزرعة الخلية.
100 وحدة / مل بنسلين و 100 وحدة / مل ستربتومايسين			تستخدم أثناء واجهة الهواء والسائل للثقافات العضوية. تتم إضافة هذه الوسائط إلى الجزء الخارجي من إدراج مزرعة الخلية.
0.4 مجم / مل هيدروكورتيزون			يستخدم أثناء واجهة الهواء والسائل للثقافات العضوية. تتم إضافة هذه الوسائط إلى الجزء الخارجي من إدراج مزرعة الخلية.
5 مجم / مل أنسولين			يستخدم أثناء الواجهة بين الهواء والسائل للثقافات العضوية. تتم إضافة هذه الوسائط إلى الجزء الخارجي من إدراج مزرعة الخلية.
1.8 وmiddot ؛ 10-4 م أدينين ؛			تستخدم أثناء واجهة الهواء والسائل للثقافات العضوية. تتم إضافة هذه الوسائط إلى الجزء الخارجي من إدراج مزرعة الخلية.
5 مجم / مل ترانسفيرين			يستخدم أثناء واجهة الهواء السائل للثقافات العضوية. تتم إضافة هذه الوسائط إلى الجزء الخارجي من إدراج مزرعة الخلية.
2 & middot ؛ 10- 11 م ثلاثي يودوثيرونين ؛			تستخدم أثناء واجهة الهواء والسائل للثقافات العضوية. تتم إضافة هذه الوسائط إلى الجزء الخارجي من إدراج مزرعة الخلية.
التربسين	بيوبوليس المشتركة	0.125٪ التربسين / فيرسين الرقم الهيدروجيني 7.0 + 0.3	تستخدم لتربسين الخلايا

وسائط الصحية الكبيرة الصحية مادة مضافة الخلايا < td colspan = "4" ><قوي>الأجسام المضادة الأولية الغربية مرافق

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

تحسين 2D و 3D الجلد في المختبر نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles