Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones
Summary
Este protocolo presenta un método para llevar a cabo cuantitativa, de una sola célula en el análisis in situ de la expresión de la proteína a estudiar especificación linaje en embriones de preimplantación ratón. Los procedimientos necesarios para la recogida de los blastocistos, todo el montaje de detección de inmunofluorescencia de las proteínas, se describen las imágenes de las muestras en un microscopio confocal, y la segmentación nuclear y análisis de imágenes.
Abstract
Este protocolo presenta un método para llevar a cabo cuantitativa, de una sola célula in situ análisis de expresión de la proteína a estudiar especificación linaje en la preimplantación de embriones de ratón. Se describen los procedimientos necesarios para la recogida de embriones, la inmunofluorescencia, la formación de imágenes en un microscopio confocal, y la segmentación de imágenes y análisis. Este método permite la cuantificación de la expresión de múltiples marcadores nucleares y el espacial (XYZ) coordina de todas las células en el embrión. Se aprovecha de minutos, una imagen herramienta de software de segmentación desarrollado específicamente para el análisis de imágenes confocal de preimplantación de embriones y las colonias de células madre embrionarias (ESC). MINUTOS lleva a cabo la segmentación nuclear sin supervisión a través de la X, Y y Z dimensiones, y produce la información sobre posición de la célula en el espacio tridimensional, así como los niveles de fluorescencia nucleares para todos los canales con la entrada del usuario mínima. Mientras que este protocolo se ha optimizado para el análisis de imágenesde preimplantación de embriones de ratón etapa, que puede ser fácilmente adaptado para el análisis de cualquier otras muestras que exhiben una buena relación señal-ruido y donde la alta densidad nuclear supone un obstáculo para la segmentación de imágenes (por ejemplo., análisis de expresión de células madre embrionarias (ESC ) colonias, células en cultivo, los embriones de otras especies o etapas, etc.) de diferenciación.
Introduction
El embrión de preimplantación ratón es un paradigma para el estudio de la aparición y el mantenimiento de la pluripotencia in vivo, así como un modelo para el estudio de la especificación del destino celular y la epitelización de novo en mamíferos. Las etapas de preimplantación de desarrollo de los mamíferos están dedicados a la creación de los tres linajes de células que componen el blastocisto, a saber, el epiblasto pluripotenciales – que da lugar a la mayoría de los tejidos somáticos y las células germinales – y dos linajes extraembryonic, la trophectoderm (TE) y la endodermo primitivo (PRE) (Figura 1A) 1,2. Este protocolo describe los procedimientos a (1) los embriones de ratón de la cosecha y fijar fase de preimplantación, (2) realizar inmunofluorescencia para etiquetar proteínas de interés, (3) llevar a cabo todo el montaje de imágenes utilizando un microscopio confocal con capacidades y Z-seccionar (4) realizar la segmentación nuclear de imágenes confocal y análisis de imagen cuantitativo subsiguiente. Este gasoducto permite tque Unbiased medición de los niveles de proteína para la asignación de identidades de células para caracterizar subpoblaciones de células in situ. Este protocolo puede ser llevado a cabo en tan poco como 3 – 4 días para un sola camada (generalmente hasta 10 embriones de ratón), de la colección de embrión para el análisis de datos (Figura 1B). El análisis simultáneo de varias camadas aumentaría la formación de imágenes y análisis de datos carga de tiempo, extendiendo así la longitud total del protocolo.
El embrión de preimplantación etapa ratón es un sistema experimentalmente tratable que, dado su pequeño tamaño y morfología estereotipada 3, es muy adecuado para formación de imágenes en toto de procesos celulares con resolución de una sola célula. Para llevar a cabo un análisis imparcial, a nivel de sistemas de un número estadísticamente relevante de embriones, un ducto de análisis cuantitativo automatizado es deseable. Sin embargo, debido a la alta densidad nuclear de la masa celular interna (ICM) del blastocisto ( <strong> Figura 1A, 2D), plataformas de segmentación de imágenes convencionales no proporcionan la suficiente precisión para establecer un flujo de trabajo automatizado o semi-automatizado. Por otra parte, la segmentación manual, mientras que precisa, no permite el procesamiento de grandes cohortes de células y embriones, ni es adecuado para una determinación reproducible, no sesgada de las identidades de células – que es especialmente crítico en el estudio de las etapas de desarrollo donde los patrones de marcador expresión no se han resuelto por completo (por ejemplo, no presentan una distribución binaria en una población). Recientemente hemos desarrollado y validado un método de segmentación de imágenes adaptada a embriones en fase de preimplantación ratón y de células madre embrionarias de ratón (CES) que logra una alta precisión, mientras que requiere una intervención mínima del usuario 4-8.
El análisis de tuberías que se presenta aquí gira en torno a la herramienta de segmentación de imágenes basados en MATLAB modular interactivo Nuclear Segmentación (minutos) 4. p MINUTOSerforms Segmentación nuclear sin supervisión de grandes lotes de confocal Z-pilas después de que el usuario ha establecido un número mínimo de propiedades de imagen, usando una interfaz gráfica de usuario (GUI) (Tabla 1) 4. Este oleoducto ha demostrado eficaz para la generación de datos de alto rendimiento en la expresión de proteínas y la localización celular en tanto de tipo salvaje, experimentalmente tratados y los embriones y los CES 5-7 modificado genéticamente. En el presente protocolo, se describe la aplicación de minutos para la segmentación de imágenes de preimplantación de embriones de etapa. Para ver ejemplos de rendimiento MINUTOS en CES por favor refiérase a 4,7. La etapa de segmentación nuclear automatizado reduce significativamente la carga de tiempo del proceso de identificación de células, mientras que las mediciones de la intensidad espacial y de fluorescencia permiten una determinación imparcial de las identidades de células y la generación de mapas tridimensionales de los dominios de expresión de genes y la posición de células en el embrión (figura 1C </strong>). Además, la escalabilidad de este flujo de trabajo hace que sea aplicable al análisis de camadas individuales a través de grandes cohortes de embriones tratados experimentalmente, o embriones de diferentes orígenes genéticos 5,6. MINUTOS está disponible gratuitamente en http://katlab-tools.org (el software requiere una licencia de MATLAB).
No se enfoque desarrollado hasta la fecha permite la generación de dichos datos en profundidad sobre la expresión de proteínas y localización celular en la preimplantación de embriones de ratón. Todos los intentos hasta ahora en la cuantificación de estos tipos de datos se han limitado a la determinación manual y la cuantificación del número de células para diferentes poblaciones en el embrión (ya sea totalmente manual o asistida por software) 9-19. Este enfoque (que incorpora el software minutos) ha sido adaptado para y probado en la preimplantación de embriones de ratón y los CES; sin embargo su rendimiento en otros sistemas con alta densidad nuclear, aunque aún no probado, se espera que sea equivalente.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente protocolo describe un método para llevar a cabo un análisis cuantitativo de todo el montaje de inmunofluorescencia en la preimplantación de embriones de ratón etapa. Un protocolo de inmunofluorescencia robusta 22 va seguida de alta resolución, todo el montaje de imagen confocal y por la segmentación de imágenes utilizando una pieza de software a la medida de 4. Aunque la elección del protocolo de inmunofluorescencia no es crítica, nos encontramos con el que se presenta aquí <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
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