Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme
Summary
This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson’s disease.
Abstract
Parkinson hastalığı (PH) moleküler yollar incelemek ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi amacıyla, bilimsel araştırmacılar hayvan modellerinde güveniyor. PD-ilişkili genlerin belirlenmesi, genetik PD modelini geliştirilmesine yol açmıştır. En transgenik α-SYN fare modelleri kademeli α-SYN patolojiyi geliştirmek ama net dopaminerjik hücre kaybı ve dopamin-bağımlı davranış açıkları görüntülemek için başarısız. Bu engel PD-ilişkili genleri fazla sentezleyen viral vektörlerin ile substantia nigra doğrudan hedefleme ile üstesinden oldu. viral vektörler kullanılarak yerli gen dağıtım merkezi sinir sisteminde transgenleri ifade için çekici bir yol sağlar. Spesifik beyin bölgelerinde (örneğin, substantia nigra) hedeflenebilir, sentezleme yetişkin ortamda indüklenebilir ve yüksek ekspresyon seviyeleri elde edilebilir. Bundan başka, çeşitli virüsler ile ilgili olarak farklı vektör sistemleri kullanılabilir. protokol bir viral vektör gerçekleştirmek için bütün önemli adımlar özetlenirSıçan substantia nigra enjeksiyon Parkinson hastalığı için bir viral vektör bazlı alfa-sinüklein hayvan modeli geliştirmek için.
Introduction
PD patofizyolojisini incelemek ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi amacıyla, yakından insan PH nöropatoloji, fizyoloji ve motor semptomları benzer hayvan modellerinde için acil bir ihtiyaç vardır. yüksek öngörü değeri, daha iyi biz hastalara hayvan modellerinde yeni tedaviler çevirebilir.
1997 yılında ilk PARK geninde gibi alfa-sinüklein keşfi (α-sin) ilk genetik PD modelini gelişmesine yol açmıştır. İnsan doğal tip (WT) veya mutant (A30P, A53T) aşırı ifade eden transjenik farelerin, bir çok α-EŞZ son on yıl içinde oluşturulmuştur. α-EŞZ aşırı ifadesinin düzeyleri patoloji gelişiminde çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca fare suşu, endojen α-sin ve tam uzunlukta veya kesik bir şekilde ifade edilip varlığı veya yokluğu, (Magen ve Chesselet 1 ile ayrıntılı bir inceleme) rol oynar. WT ve insan çeşitli klinik mutantlar hem aşırı ekspresyonu &# 945; transgenik farelerin -SYN α-SYN patolojik birikimi ve nöronal disfonksiyon 2-6 uyarır. Ancak, şimdi en transgenik α-SYN fare modelleri berrak dopaminerjik hücre kaybı ve dopamin-bağımlı davranış açıkları görüntülemek için başarısız kadar.
Bu engel α-SYN fazla sentezleyen viral vektörlerle substantia nigra (SN) doğrudan hedefleme ile üstesinden oldu. Viral vektörler kolayca hücreleri enfekte ev sahibi genoma genetik malzemeyi vermek ve yeni virüs parçacıklarının üretilmesi amacıyla viral genomu çoğaltmak için konakçı hücrenin zorlayabilir virüslerden türetilir. Virüsler hücrelerine girip genlerin katılmasıdır yeteneklerini muhafaza replike olmayan viral vektörler için tasarlanmış olabilir. Viral genomun parçalarını silme ve ilgi genleri tarafından değiştirmek suretiyle, vektör uygulanması genellikle "transdüksiyon" olarak adlandırılan bir konakçı hücre, replikasyon olmaksızın tek bir tur enfeksiyona neden olur. Viral vektörler CıBir aşırı ekspresyonu, gen susturma hem de kullanılabilir. Ifade transgen bir raportör protein (örneğin, yeşil fluoresan protein ya da ateşböceği lusiferaz) 7, bu yazıda üzerinde durulacak bir terapötik gen terapi uygulamaları 8-10 protein ya da olabilir, bir hastalıkla ilişkili proteinin hastalıkta modelleme 11 için kullanılan -14.
Viral vektör aracılığıyla gen teslimi birçok avantaj CNS'de transgenleri ifade için alternatif bir yöntem sağlar. lokal transgen uygulama kullanıldığında spesifik beyin bölgelerinde hedeflenebilir. Dahası, transgen ifade gelişimi sırasında telafi mekanizmalarının riskinin azaltılması yetişkinlik döneminde teşvik edilebilir. Ayrıca, modeller farklı türler ve suşları oluşturulabilir. Ve son olarak, farklı transgenler kolaylıkla birleştirilebilir. viral vektörler kullanılarak yüksek transgen sentezleme seviyeleri hastalığın başlama ve şiddeti genellikle overexp düzeyine bağlı olduğundan çok önemli olabilir, elde edilebilirdışarı yansıması.
farklı virüsler dayalı çeşitli vektör sistemleri geliştirilmiştir. bir vektör sisteminin seçimi, ilgi konusu genin, gen ekspresyonu, hedef hücre ve biyo-güvenlik sorunları gerekli süre büyüklüğüne bağlıdır. bu kemirgen beyin etkili ve uzun vadeli gen ifadesini yol açacağından beyin, lentiviral (IV) 'de sabit gen transferinin ve rekombinant adeno-ilişkili viral, (rAAV), vektörler artık tercih edilen vektör sistemleri kabul edilmektedir. SN dopaminerjik nöronların (DN) özel hedeflemesi için rAAV vektörleri yavaş yavaş nedeniyle yüksek titreleri ve DN transdüksiyon verimliliği LV vektörleri outcompeted var.
Şu anda mevcut en iyi α-EŞZ göre kemirgen modelleri yeni AAV serotiplerinin kullanan bir birleşik yaklaşım adlı geliştirilmiştir (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) ve vektör yapıları, titerleri, ve saflık 15,16 optimize edilmiştir. vektör titresi yanı sıra vektör saflık doğrudan etkiliyorModelin fenotipik sonucu. Aşırı vektör titreleri ya da yeterli saflaştırılmış vektör toplu spesifik olmayan toksisite ile sonuçlanabilir. Bu nedenle, uygun kontrol vektörleri vazgeçilmezdir. Viral vektör üretimi, yükseltme ve saflaştırma işlemlerinde önemli zaman yatırımı da tekrarlanabilir ve yüksek kaliteli vektör toplu elde etmek için gerekli kanıtlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
protokolü içinde birkaç kritik adımlar vardır. vektör titresi yanı sıra vektör saflık doğrudan modelin fenotipik sonuçlarını etkiler. Aşırı vektör titreleri ya da yeterli saflaştırılmış vektör toplu spesifik olmayan toksisite ile sonuçlanabilir. Bu nedenle, yüksek kaliteli vektör gruplar ve uygun kontrol vektörlerin kullanılması kaçınılmazdır. Bundan başka, stereotaksik çerçeveye sıçan kafasının tam olarak konumlandırılması ve koordinatları doğru belirlenmesi substantia nigr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar mükemmel teknik yardım için Joris Van Asselberghs ve Ann Van Santvoort teşekkür ederim. Araştırma AT-FP6 programı 'Dimi' (LSHB-CT-2005-512146), 7.ÇP RTD proje MEFOPA (SAĞLIK tarafından, IWT-Vlaanderen (/ 80020 IWT SBO), FWO Vlaanderen (G.0768.10) tarafından finanse edildi -2.009-241791), 7.ÇP programı 'Inmind' (SAĞLIK-F2-2011-278850), KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, İmir PF / 10/017), ve MJFox Vakfı (Hedef doğrulama 2010). A. Van der Perren ve C Casteels Bilimsel Araştırma Flaman Fonu doktora sonrası adamlar vardır. K. Van Laere Bilimsel Araştırma Flaman Fonu üst düzey bir klinik üyesidir.
Materials
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
References
- Magen, I., & Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 184, 53-87 (2010).
- Masliah, E. et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C. et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., & Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J. et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., & Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., & Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P. et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L. et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D. et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D. et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E. et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., & Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Van der Perren, A., Van den Haute, C., & Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease. Curr Top Beh Neurosci. (2014).
- Van der Perren, A. et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. (2014).
- Van der Perren, A. et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., & Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., & Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. (2015).
- Dale, G. E. et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L. Neurobiology of flies and mice. Science. 288, 631-632 (2000).
- Dawson, T., Mandir, A., & Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle? Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H., 3rd. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M. et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, 44 (2013).
