Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.
The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis.
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories.
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.
Hästdjur herpesvirus-2 (EHV-2) är inblandad i en respiratorisk sjukdom, med potentiella kliniska manifestationer, såsom nästäppa, faryngit och svullna lymfkörtlar 1-3. Detta virus är också misstänks vara associerad med dålig prestanda av hästar, vilket kan resultera i en betydande och negativa ekonomiska konsekvenser för hästnäringen 2.
Fram till nu, den gyllene standarden för gamma-EHV (γ-EHV) upptäckt var cellodlingsmetoden. Den första olägenheten med detta förfarande var frånvaron av diskriminering mellan EHV-2 och andra γ-EHV s (t.ex. EHV-5). Den andra besvär var den långsamma utvecklingen av den cytopatiska process, som tar från 12 till 28 dagar för att manifestera 4,5.
Att en validerad och normaliserad kvantitativ realtids-polymeraskedjereaktion (QRT-PCR) metoden hjälper att snabbt upptäcka viruset, för att diskriminera mellan EHV-2 och EHV-5 och för att studera förhållandet mellan det virala genomet belastningen och sjukdoms tack vare kvantifieringen aspekten.
Polymeraskedjereaktion (PCR) beskrevs för första gången 1986 av Mullis 6 och är på väg att bli den nya guldstandarden i de flesta av områdena biologisk diagnos (human, miljö och veterinärmedicinska). Denna metod, som är baserad på amplifiering av en del av genomet av patogener, presenterar många fördelar: specificitet, känslighet och snabbhet. Dessutom är risken för kontaminering amplikon receded sedan tillkomsten av QRT-PCR och kvalitetssäkring 7. Ändå krävde ett erkännande av PCR som en ny guldstandardmetod mer än bara förbättrad prestanda data, men också demonstration av kontrollen av utvecklings- och validerings stegen i hela metoden utan försämring av prestanda över tiden.
Den första molekyls verktyg som används för detektion av EHV-2 var tids consuming och inblandade icke-specifik amplifiering med innesluten PCR, följt av sekvensering 8. De riktade generna för herpesvirus var deoxiribonukleinsyra (DNA) polymeras och DNA-förpackning 9. Men kapslad PCR utgör en stor risk för kontaminering av amplikoner. Sedan dess har konventionella PCR-test tagits fram för att förstärka interleukin 10-liknande gen eller glykoprotein B-genen, ses över 2009 2. På senare tid har realtids-PCR egenskaper beskrivs för kvantifiering av EHV-2 10 men inga uppgifter fanns tillgängliga om validering av hela förfarandet innefattar extraktionsprocessen.
I detta protokoll är utvecklings- och valideringsförfaranden beskrivs för en kvantitativ PCR-metod för detektion och kvantifiering av EHV-2 DNA i hästdjur andnings vätskor enligt Association française de norma (AFNOR) norm NF U47-600 3,11,12, vilket är den franska representant iden internationella normalisering kommitté. Denna norm detaljerna "Krav och rekommendationer för genomförande, utveckling och validering av veterinär PCR i djurhälsa analysmetod" 11,12, enligt NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 och OIE (Världsorganisationen för djurhälsa) . rekommendationer, 2010 14 EHV-2 QRT-PCR validerings innebär ett tredelat förfarande: (a) utveckling av QRT-PCR-analys, (b) karakterisering av QRT-PCR-analys ensam och (c) karakterisering av hela analysmetod (från extraktion av nukleinsyror från det biologiska provet till PCR-analys).
Karakterisering av QRT-PCR-analys och hela analysmetoden innefattar definitionen av två gränser: detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ). LOD 95% PCR representerar det lägsta antalet nukleinsyra kopior per volymenhet som kan detekteras i 95% av alla cases. LOQ 95% PCR representerar den lägsta mängden nukleinsyra kopior som kan bestämmas med hänsyn till osäkerheterna.
Detta QRT-PCR-metoden gör det möjligt att exakt upptäcka och snabb kvantifiering av EHV-2 i vätskor i andningsorganen. Dessutom skulle metoden kunna tillämpas i andra laboratorier för att säkerställa ett standardiserat förfarande och som allmän mall för utveckling av andra nya QRT-PCR-analyser.
Sedan 2000-talet har realtids-PCR har ersätta guld standardtekniker (cellodling och bakterier odlingsmetoder) i ett ökande antal laboratorier. Genomförande av tekniken är relativt lätt. Men validering av laboratoriemetoder är avgörande för molekylär detektion och kvantifiering av patogener för att säkerställa korrekt, repeterbara och tillförlitliga uppgifter.
Eftersom extraktionssteget är den primära källan för förlust av biologiskt material, kan det anses vara den främsta källan till oriktig kvantifiering mellan ett protokoll och en annan. Som sådan, skapandet av en standardkurva för DNA-plasmid under QRT-PCR, främst rapporterats i litteraturen, anger det virala genomet belastningen men tar inte hänsyn till extraktionssteget.
Beskrivning av en de novo strategi för en hel metod valideringsprocess i AFNOR normen NF U47-600-2 utgör en betydande framsteg på detta område. Såsom illustreras idetta papper för EHV-2 hos hästar, eller av andra i bin 21 nödvändiggör detta tydlig differentiering mellan framkallningssteget och valideringen steg med karakterisering av PCR och karakterisering av hela metoden. En begränsning i detta intressant metod är att någon förändring i protokollet kommer att resultera i skyldighet att förlänga hela processen som kan vara mycket kostsamt. Denna begränsning uppmärksammades också av det faktum att gränserna för kvantifiering beroende på källan från vilken viruset utvinns (t.ex. vätskor andnings, organ, blod eller urin). I själva verket presenterar varje matris olika specificiteter i sina fysikalisk-kemiska egenskaper och det är viktigt att definiera oberoende vid varje annan matris som används för viral detektion och kvantifiering av QRT-PCR. Således kan det virala genomet belastning av varje biologiskt prov kvantifieras mer exakt från utvinning. Karakteriseringen tar också hänsyn till termo model och när användning av en tidigare väldefinierad metod (t.ex. EHV-2 qPCR metod som beskrivs i detta dokument) kräver en ny typ av maskin i moder laboratorium eller annat laboratorium, måste man bekräfta resultatet av detta instrument. Bekräftelsen av hur en qPCR analys är en förutsättning för alla tester sätta i ett laboratorium. Detta uppnås normalt genom att analysera ett referensprov med kända egenskaper. En sådan kontroll är en förutsättning och betraktas som obligatoriska som begärts av NF 47-600-1 AFNOR norm för att validera prestanda qPCR (LOD, LOQ effektivitet) och robustheten i hela metoden (LOD, LOQ). Inte bara under utveckling och karakterisering steg men även när de används i forskning eller för diagnostiska ändamål, kan riskfaktorer identifieras och kontrolleras väl för att säkerställa standardiseringen av protokollet. Särskilt oroande är tillräcklig personalutbildning, högkvalificerad personal, kvalitetskontroll av förbrukningsbegagnade och lagring, kontroll av de omedelbara miljöförhållanden och medvetenhet om metrologiska förhållanden som kan påverka utförandet av vetenskapliga instrument som är involverade i analysen. Användning av referensprover för mellan laboratorier jämförelser kan också hjälpa till att kontrollera de osäkerheter. På detta sätt kan jämförelse av data mellan laboratorier underlättas. I själva verket mellan laboratorier kompetenstest är viktigt att utvärdera och bekräfta metodens reproducerbarhet.
Virala genomet last resultat som uttrycks i internationella enheter (IE) av det analyserade biologiska matrisen (IU: kopior / ml för vätskor eller kopior / g för vävnader) är lättare att använda för att jämföra resultat mellan olika laboratorier. Alla resultaten ovan LOQ uttrycks som kopior / ml och ett resultat mellan LOD och LOQ tas som en icke-kvantifierbar positivt resultat. Presenter kvantifieringsdistributionen uppgifter av genomet på detta sätt överensstämmer mer exakt till de process analyser (amplifiering av genomet). I själva verket, i cellodlingsexperiment, uttryck av den virala belastningen genom TCID50 (median vävnadskultur smittsam dos) är beroende på beskaffenheten av cellerna och virusstammar. Varje stam linje besitter unika infektion kinetik och vissa virus som EHV-2 kan ta flera dagar innan den första cytopatogena effekten är uppenbar.
Sammanfattningsvis bör denna nya metod för karakterisering av QRT-PCR underlätta harmoniseringen av datapresentation och tolkning mellan laboratorier. Detta kommer att vara mycket användbar för potentiella nya tillämpningar av QRT-PCR i framtiden som inrättandet av en cut-off-värdet för förklaring av sjukdomsstatus i stället för att bara närvaron eller frånvaron av patogen.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Sophie Castagnet and Nadia Doubli-Bounoua for their technical support. This work received financial support from the General Council of Calvados and the agreement of Region Basse-Normandie and French Government (CPER 2007-2013; project R25 p3). The authors would like to thank the experts of the AFNOR group and particularly Jean-Philippe Buffereau and Eric Dubois.
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate | Dutsher | 16924 | |
Adhesive film QPCR Absolute | Dutsher | 16629 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
0.5 mL microtubes, skirted, caps | Dutsher | 039258 | |
Ethanol 98% | Sodipro | SAF322941000 | |
Primers | Eurofins | Custom order | |
Probe | Life Technologies | Custom order | |
Plasmid | Eurofins | Custom order | |
QIAamp RNA viral Mini Kit (containing: QIAamp Mini column, AVL buffer, AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) |
Qiagen | 52906 | AVL buffer: pre-warm 5 min at 72°C |
Sequencing by Sanger method | Eurofins | Custom order | |
Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4364340 | |
Tris-EDTA buffer solution | Santa Cruz | sc-296653A | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-2000C | |
StepOnePlus Real-Time PCR systems | Life Technologies | 4376600 | pre-warm 15 min |