العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة
Summary
المقدمة هنا هي طريقة واضحة لعزل وتدفق تحليل cytometric من الخلايا وحيدة النواة الدم المحيطي-التسلل الورم يمكن أن ينتج تعتمد على الوقت بيانات كمية عن وضع عدد وتنشيط الخلايا المناعية التي تدخل المبكر المكروية ورم في المخ.
Abstract
وقد أظهرت مختبرنا مؤخرا أن القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا قادرة على القضاء على زرع orthotopically GL26 الماوس والفئران CNS-1 الاورام الدبقية الخبيثة قريبا بعد engraftment داخل الجمجمة إذا أديت الخلايا السرطانية نقص في التعبير عنها من كتين galectin β-غالاكتوزيد ملزم -1 (غال-1). مزيد من العمل مؤخرا يقول إن عدد سكانها GR-1 + / + CD11b خلايا الدم النخاعي أمر بالغ الأهمية لهذا الغرض. لفهم أفضل للآليات التي NK وخلايا الدم النخاعي التعاون لمنح رفض الورم غال-1-نقص قمنا بتطوير بروتوكول شامل لعزل وتحليل خلايا الدم وحيدات النوى الطرفية-التسلل الورم (PBMC). ويتجلى الأسلوب هنا بمقارنة PBMC تسلل إلى المكروية الورم من غال-1، معربا عن GL26 الاورام الدبقية مع أولئك الذين أصبحوا غال-1-ناقص عبر shRNA ضربة قاضية. بروتوكول يبدأ مع وصفا لكيفية الثقافة وإعداد GL26 مLLS للتلقيح في مسانج C57BL / 6J مخ الفأر. ثم يوضح الخطوات المتبعة في عزلة وتدفق تحليل cytometric من PBMCs-التسلل الورم من أوائل المكروية ورم في المخ. هذه الطريقة قابلة للتكيف مع عدد من التصاميم التجريبية في الجسم الحي التي تتطلب بيانات الزمنية على تسلل المناعة في الدماغ. طريقة حساسة وقابلة للتكرار للغاية، كما PBMCs-التسلل الورم يمكن عزله عن الأورام داخل الجمجمة في أقرب وقت 24 ساعة بعد ورم engraftment مع عدد خلايا مماثلة لوحظ من وجهة يقابل الأورام وقت خلال تجارب مستقلة. A التجريبي واحد يمكن أن تؤدي الأسلوب من حصاد الدماغ لتحليل تدفق cytometric من PBMCs-التسلل الورم في ما يقرب من 4-6 ساعة اعتمادا على عدد من العينات لتحليلها. كما يمكن استخدام نماذج الورم البديلة و / أو الأجسام المضادة الكشف عن خلية محددة وفقا لتقدير التجريبيون على تقييم تسلل العديد من إمان أخرىأنواع الخلايا (ه) من الفائدة من دون الحاجة لإجراء تعديلات على الإجراء العام.
Introduction
الاورام الدبقية هي فئة من سرطانات الدماغ الظهارية العصبية الناجمة عن الدبقية تتحول داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS). جميع الاورام الدبقية، ومنظمة الصحة العالمية (WHO) الصف الرابع الورم، أو ورم أرومي (GBM)، هو الأكثر شيوعا وفتكا 1. GBM هو صهر للغاية لرعاية المعايير من الحالية التي تتكون من الورم استئصال إلى أقصى حد ممكن تليها الأشعة بالإضافة إلى العلاج الكيميائي وما يصاحبه من المواد المساعدة مع temozolomide 2. هذه السرطانات القاتلة تحمل أحوال الطقس الكئيب أشهر فقط 15-18 من البقاء على قيد الحياة من وقت التشخيص الأولي مع 5٪ فقط من المرضى على قيد الحياة المرض بعد 5 سنوات 3.
وجود حاجز الدم في الدماغ (BBB)، أدت عدم وجود خلايا مقدمة للمستضد المهنية (ناقلات الجنود المدرعة)، ووجود مجهولون في وقت سابق من الهياكل اللمفاوية الحسنة النية داخل الدماغ 4 لمفهوم GBM حظا المناعة كما. ومع ذلك، العديد من الدراسات SHO الآن ث أن هذه السرطانات الدماغ في الواقع يولد تجنيد الخلايا المناعية الطرفية التي هي في الغالب النخاعي في الأصل والتي تشمل حيدات، الضامة، والخلايا القامع المستمدة النخاعي (MDSCs) 5. كما يؤثر GBM نشاط المقيمين في الدماغ الدبقية الصغيرة لتصبح مؤيدة للمكون للأورام 6،7. الخلايا اللمفاوية مثل خلايا CD8 + T 8 و CD56 + الخلايا القاتلة الطبيعية 9 موجودة أيضا داخل المكروية الورم، لكن بأعداد أقل بكثير، وهذه حقيقة يعتقد أن يكون راجعا إلى وظيفة المثبطة للمناعة بتحريض من العوامل المستمدة من الورم في ورم المرتبطة الضامة ( TAMS) 10. خلايا CD4 + T موجودة أيضا في GBM، ولكن الكثير من هذه الفئة من السكان تعرب عن قلقها أيضا CD25 وFoxP3، صناع مناعة T التنظيمي (T ريج) خلايا (11). الدولة المثبطة للمناعة العامة للGBM يتوج في تعزيز الهروب المناعية والأورام تقدم 12.
<p class= "jove_content"> فهم أفضل للآليات GBM المناعة أمر بالغ الأهمية لوضع استراتيجيات فعالة immunotherapeutic تهدف إلى تحفيز الجهاز المناعي ضد الورم. على مدى السنوات ال 15 الماضية عملت مختبرنا للتغلب على آليات الدماغ ورم immunosuppresson من أجل تطوير فعال immunotherapeutics جديدة لمكافحة GBM 13-19. وقد أدى تتويجا لهذا العمل الآن لتجربة سريرية تهدف إلى تقييم السامة للخلايا جنبا إلى جنب والعلاجية المناعة تنشيطية لمرضى شخصت حديثا GBM (ClinicalTrials.gov معرف: NCT01811992).يظهر عملنا الأحدث التي GL26 الماوس والفئران CNS-1 خلايا GBM كتلة مضادة للورم الخلايا NK المراقبة المناعي عن طريق إنتاج كميات كبيرة من الربط β-غالاكتوزيد-كتين galectin-1 (غال-1) 20. وقد تجلى ذلك من خلال قمع التعبير عن غال-1 في خلايا الورم باستخدام shRNA بوساطة ضربة قاضية الجينات. في المختبر التجربهوأظهرت البحوث أن خلايا الورم غال 1-نقص انتشرت عادة في الثقافة، ولكن خضعت الرفض السريع قريبا بعد engraftment داخل الجمجمة في مسانج C57BL / 6J أو RAG1 – / – الفئران، وبالتالي تأسيس استقلال T- أو B- الخلايا على هذا الشكل من رفض الورم. NK immunodepletion الخلايا مع anti-asialo GM 1 المصل المضاد أو الأجسام المضادة وحيدة النسيلة NK1.1 أدى إلى الاستعادة الكاملة لنمو الورم داخل القحف غال-1-نقص، وإنشاء دور الخلايا القاتلة الطبيعية في غال-1-نقص رفض الورم. وتبين لنا الآن أن immunodepletion من GR-1 + / CD11b + خلايا الدم النخاعي غير كافية لمنع غال-1-نقص رفض الورم على الرغم من وجود خلايا NK، مما يكشف عن دور مساعد لا غنى عنه لخلايا الدم النخاعي في العون من غال NK بوساطة تحلل الورم -1-ناقص (بيانات غير منشورة). وأدت هذه النتيجة غير متوقعة لنا لوضع بروتوكول شامل لعزل وتحليل خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) أنالتسلل المكروية ورم في المخ بعد وقت قصير من engraftment داخل الجمجمة حتى يتسنى لنا أن تميز أفضل الأحداث تسلل المناعية التي المسند غال-1-نقص رفض الورم.
ويتجلى الأسلوب هنا باستخدام خلايا الورم الماوس GL26 أن mCitrine صريحة جوهري البروتين الفلوري، ودعا GL26-سيت، والتي تسمح المباشر التصور الخلايا السرطانية بواسطة المجهر مضان 21. وهذه الخلايا المغروسة stereotactically في الدماغ من مسانج C57BL / 6J الفئران ويسمح لتنمو لمدة 24، 48، أو 72 ساعة قبل الماوس القتل الرحيم. ثم يتم عزل PBMCs-التسلل الورم وimmunolabeled استخدام الألغام المضادة -CD45، -Gr-1، -CD11b و-NK1.1 الأجسام المضادة سطح الخلية مع immunolabeling داخل الخلايا لجرانزيم B (GzmB). هذه تركيبة معينة من الأجسام المضادة يسمح لتحديد-التسلل الورم GR-1 + / + CD11b خلايا الدم النخاعي وNK1.1 +، وخلايا NK، أنواع الخلايا لدينا بالتابعين المتورطين في رفض الورم غال-1-ناقص. ملف تسلل المناعي للغال-1-نقص GL26-سيت الورم، ويشار إليها هنا ب GL26-سيت-gal1i، ثم يتم مقارنة بما كان عليه من الاورام الدبقية التعبير عن المستويات العادية من غال-1 يسمى GL26-سيت-NT التي تحتوي على عدم تستهدف السيطرة shRNA القاسي. بروتوكول يبدأ مع الوصف على كيفية الثقافة الخلايا GL26-سيت الورم في المختبر، والتي تبعتها شرحا عن كيفية تدبر orthotopically هذه الخلايا في الجسم المخطط من مسانج C57BL / 6J الفئران. ومن ثم تمضي إلى تعداد الخطوات المتبعة في عزلة وimmunolabeling من PBMCs-التسلل الورم لتحليل تدفق cytometric. ويخلص البروتوكول مع شرح لتحليل البيانات القياسية وتمثيل رسومي.
تكشف المظاهرة أن كلا من GR-1 + / + CD11b خلايا الدم النخاعي وخلايا NK1.1 + NK تتراكم تفضيلي ضمن المكروية ورم في المخ غال-1-نقص في غضون 48ساعة من زرع الورم، ونتيجة لذلك مما يساعد على تفسير سبب هذه الأورام الخضوع بسرعة كامل الورم تحلل حوالي 1 أسبوع engraftment بعد ورم-20. هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة إلى عدد من مختلف في الجسم الحي التصاميم التجريبية التي تتطلب بيانات الزمنية على تسلل المناعة في الدماغ. A التجريبي واحد يمكن أن تؤدي البروتوكول من حصاد الدماغ لتحليل تدفق cytometric من PBMCs-التسلل الورم في حوالي 4-6 ساعة اعتمادا على عدد من العينات لتحليلها. ويمكن أيضا طريقة دمجه مع التجارب التي تهدف إلى تميز الملف الشخصى تعميم PBMCs في الفئران الحاملة للورم للمقارنة مع تلك التي تتسلل إلى الدماغ وذلك لتحديد الظواهر كبت المناعة بفعل تحديدا المكروية الورم. تطبيق هذا وما شابهه من الأساليب ينبغي أن تيسر فهم أفضل للعوامل متورطة في تهريب الخلايا المناعية الطرفية في المكروية ورم في المخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة قوية وقابلة للتكرار للعزلة وتدفق cytometric تحليل PBMCs التي تسللت الماوس في وقت مبكر ورم في المخ المكروية. يتم إنشاؤها تعليق خلية الورم في تركيز يحددها التجريبي التي المغروسة stereotactically في المخطط من مخ الفأر. ثم يصرح باستخدامها الفئران في نقطة زمنية …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NIH / NINDS) يمنح R01-NS074387، R01-R21 NS057711 و-NS091555 إلى MGC. NIH / NINDS منح R01-NS061107، R01-NS076991، R01-R21 NS082311 و-NS084275 لااا. المنح المقدمة من سعيد قلوب ليا، جامعة ميتشيغان مركز السرطان الشامل تمنح للMGC وPRL؛ قسم جراحة المخ والأعصاب، جامعة ميشيغان كلية الطب. معهد ميشيغان لالسريرية والبحوث الصحية، بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منحة 2UL1-TR000433. جامعة ميشيغان السرطان غرانت الأحياء التدريب بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / NCI (المعهد الوطني للسرطان) منحة T32-CA009676؛ جامعة ميشيغان التدريب في الأساسية والسريرية علم الأعصاب بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / NINDS منح T32-NS007222. وجامعة ميشيغان برنامج التدريب العلماء الطبية بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS (المعهد الوطني لعلوم الطب العام) منح T32-GM007863. المؤلفونإعادة شاكرين للقيادة الأكاديمية والدعم الذي تلقاه من الدكتور كارين Muraszko وقسم الجراحة العصبية. لM. داهلغرن، D. TOMFORD، وS. نابوليتان للدعم الإداري رائع. لM. Dzaman للحصول على المساعدة الفنية المعلقة. وفيل F. جينكينز للحصول على الدعم السخي تجاه شراء زايس 3D مجهر المسح الإلكتروني. علينا أيضا أن نعترف المختبر Kuchroo في كلية الطب بجامعة هارفارد الذي تم وضع نسخة معدلة من استراتيجية بوساطة وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي لعزل الخلايا وحيدة النواة الدماغ.
Materials
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000U/ml Penicillin; 10,000μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10ml vials |
| 0.6ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3mg/ml ampuls |
| 1ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45mm x 13mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter® Syringes 700 series; 5μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9mm diameter x 50mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9mm x 38.1mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 mL serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
- Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., & Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
- Stupp, R. et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
- Ostrom, Q. T. et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16 Suppl 4, iv1-63 (2014).
- Louveau, A. et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. 523, 337-341 Nature. (2015).
- Kennedy, B. C. et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol. 2013, 486912 (2013).
- Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., & Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., & Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
- Kmiecik, J. et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
- Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., & Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
- Wagner, S. et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
- El Andaloussi, A., & Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., & Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
- Curtin, J. F. et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10 (2009).
- Curtin, J. F. et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
- Mineharu, Y. et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
- Larocque, D. et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
- Curtin, J. F. et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983 (2008).
- Ali, S. et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
- Dewey, R. A. et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
- Baker, G. J. et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
- Baker, G. J. et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
- Ormerod, M. G., & Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. (2008).
- Stirling, D. P., & Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
- Hirai, T. et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528 (2013).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., & Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
- Wiesner, S. M. et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
- Holland, E. C. et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
- Lynes, J. et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
- de Vries, N. A. et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
- Uhrbom, L. et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
- Marumoto, T. et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
- Assanah, M. et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
