Isolering af CD 90+ fibroblast / myofibroblaster fra Human Frosne Mave Enheder
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
Fibroblaster / myofibroblaster (MFS) har vundet stigende opmærksomhed for deres rolle i patogenese og deres bidrag til både sårheling og fremme af tumor mikromiljø. Mens der i øjeblikket mange teknikker til isolering af MFIer fra gastrointestinale (GI) væv, denne protokol indføres der et nyt element i isolation af disse stromale celler fra frosne væv. Frysning GI vævsprøver ikke kun tillader forskeren at erhverve prøver fra hele verden samarbejdspartnere, biobanker, og kommercielle kreditorer, den tillader også den forsinkede behandling af friske prøver. Den beskrevne protokol vil konsekvent viser karakteristiske spindelformede celler med MF fænotype, som udtrykker CD90, α-SMA og vimentin. Da disse celler er afledt fra patientprøver, anvendelsen af primære celler giver også fordelen af nært efterligner MFIer fra sygdomstilstande-nemlig cancer og inflammatoriske tarmsygdomme. Denne teknik har bin valideret i gastrisk, tyndtarm, og colon MF primær kultur generation. Primære MF kulturer kan anvendes i en bred vifte af eksperimenter over et antal passage og deres renhed vurderet af både immunocytokemi og flowcytometri-analyse.
Introduction
Myofibroblaster / fibroblaster (MFS) udgør en rigelig population af celler i gastrointestinale (GI) slimhinde. Disse stromaceller er placeret lige under epitel og danne et sammenhængende netværk inden mucosal lamina propria i tarmen. MFIer er ikke kun ansvarlige for aflejring af den ekstracellulære matrix, men gennem parakrin regulering kan påvirke elektrolyttransport, restitution og barrierefunktion tilstødende epitel 1, 2. Endvidere har MFIer vist sig at spille en central rolle i inflammation og væv remodeling 3, 4. myofibroblaster er en kritisk del af tumormikromiljøet, hvor de er også kendt som cancerassocierede fibroblaster, og bidrage til tumorcellevækst i og fungere som en niche for cancerstamceller 3. Nye data tyder på, at MFIer også kan tjene som lokale antigenpræsenterende celler. Derudover MFIer funktion som vigtige regulatorer af medfødte og adaptive immunrespons, producing en række cytokiner og vækstfaktorer 5.
Hos raske individer, der MFS celler menes at skelne fra mesenkymale stamceller og udtrykker på deres celleoverflade, at mesenchymale markering, CD90 3, 5. Disse celler er også positive for vimentin, men negative for epitel- og hæmatopoietisk celle markering, EpCAM og CD45 , henholdsvis. Myofibroblaster er foreslået at være en aktiveret form af fibroblaster og kan skelnes fra ikke-aktiverede fibroblaster ved ekspression af α-SMA 5.
Gennem det seneste årti, flere fremgangsmåder til isolering af myofibroblaster fra humane colon mucosa er blevet offentliggjort-hovedsageligt baseret på fremgangsmåden oprindeligt beskrevet af Mahida et al. 5-8. Mens de enkelte studier rapporterer isoleringsprocedurer fra forskellige tarmslimhinden, ingen universel protokol til isolering af MFIer fra flere områder af mave-tarmkanalen (dvs., gastrisk, små og large tarmslimhinde) er blevet offentliggjort. Protokollen er præsenteret heri er blevet testet og anvendt med succes til alle tre vævstype nævnt ovenfor. . Endvidere er der ikke blevet rapporteret til isolering MFIer fra frosne GI mucosa.
Her præsenteres en optimeret fremgangsmåde, som er baseret på enzymatisk nedbrydning, og samtidig giver mulighed for isolering af menneskets tarme mucosal MFIer til kultur og flowcytometri-analyse i frisk fordøjet, enkelt celle, mucosale præparater. Denne teknik giver pålideligt primære kulturer med en MF fænotype. Endvidere kan de samme metoder anvendes til at isolere MFIer fra frosne prøver af gastriske og små tarmvæv så godt. Isolering af myofibroblaster fra frisk GI væv er tidligere blevet beskrevet; Men udnyttelsen af frosne prøver viser mange fordele. Nemlig, vil forskerne være i stand til at indsamle og lagre væv fra et vilkårligt antal af samarbejdspartnere over hele verden, der har capabiheden til at sende frosne vævsprøver. Desuden kan forskerne finde indsamling af kasserede væv fra operationsstuen og / eller endoskopi suite og umiddelbar behandling af væv til isolation i konflikt med deres nuværende eksperimenter tidsplan. Også på grund af den uforudsigelige karakter af kirurgi, kan vævsudtagning forekomme meget sent på dagen, hvilket vil begrænse tid tilbage til forarbejdning væv. Frysning væv til senere behandling vil forbedre disse udfordringer.
Endelig har disse metoder blevet anvendt med succes til isolering af colon, mave og tyndtarmen myofibroblaster i sygdomstilstande, såsom colorectalt carcinom og inflammatoriske tarmsygdomme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens denne protokol blev udviklet for anvendelsen forskning kun, i lyset af de stigende afgørende betydning af stromale celler som et potentielt kræft prognostiske biomarkører og terapeutiske mål, evnen til at fryse "funktionelle" biospecimens til senere brug tilbyder en betydelig fordel. Dette repræsenterer en unik fordel for oprettelsen af klinisk biorepository, der kan tjene som yderligere værktøjer tjener til at fremme udviklingen af personlig medicin 10, 11. Svarende til resultaterne tid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H. et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., & Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., & Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., & Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I. et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R. et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-1348 (1997).
- Roncoroni, L. et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7, 40 (2009).
- Pinchuk, I. V. et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori. Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., & Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., & Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G. et al.Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., & Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215. (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., & Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611. (2013).
- Schiller, J. H., & Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., & De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., & Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., & Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
