لتمييز المفصليات لأبحاث التشتت. يتم توضيح طرق إدارة علامات البروتين الداخلية والخارجية على المفصليات. كما يتم توضيح تقنيات الكشف عن علامات البروتين ، إما من خلال فحوصات الممتز المناعي غير المباشرة أو المرتبطة بإنزيم الساندويتش (ELISAs).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت
في هذه المقالة
ملخص
غالبا ما تستخدم البروتينات
الملخص
وغالبا ما يتطلب مراقبة الحركة المفصلية إلى فهم أفضل لديناميات المرتبطة السكاني وأنماط النثر، وتفضيلات النبات المضيف، والتفاعلات البيئية الأخرى. وعادة ما تعقب المفصليات في الطبيعة عن طريق وضع علامات عليها مع علامة فريدة من نوعها ومن ثم إعادة جمعها عبر الزمان والمكان لتحديد قدرات تشتتهم. بالإضافة إلى علامات المادية الفعلية، مثل الغبار الملون أو الطلاء، وأثبتت أنواع مختلفة من البروتينات فعالة جدا لوسم المفصليات للبحث البيئي. البروتينات يمكن أن تدار داخليا و / أو خارجيا. ويمكن بعد ذلك يتم الكشف عن البروتينات على المفصليات استعادت مع انزيم مرتبط المناعي فحص بروتين معين (ELISA). نحن هنا وصف بروتوكولات للخارجيا وداخليا علامات المفصليات مع البروتين. وأظهرت مثالين تجريبية بسيطة: (1) علامة البروتين الداخلية التي أدخلت على حشرة من خلال توفير نظام غذائي التخصيب من البروتين و (2) علامة البروتين الخارجية موضعيا لpplied لحشرة باستخدام البخاخات الطبية. نحن ثم تتصل دليل خطوة بخطوة من الساندويتش وطرق ELISA غير المباشرة المستخدمة للكشف عن علامات البروتين على الحشرات. في هذه المظاهرة، وتناقش مختلف جوانب اقتناء وكشف عن علامات البروتين على المفصليات للعلامة الافراج عن الاستيلاء، علامة التقاط، وأنواع علامة التقاط النفس من البحوث، جنبا إلى جنب مع مختلف الطرق التي كان الإجراء immunomarking تكييفها لتلائم مجموعة واسعة من أهداف البحث.
المقدمة
تتبع حركة الآفات المفصلية، وأعداء الطبيعية (الطفيليات والمفترسات)، والملقحات في الطبيعة أمر ضروري لفهم أفضل لكيفية تحسين خدمات النظام الإيكولوجي. المكون الرئيسي لمعظم أنواع البحوث تشتت هو وجود طريقة يمكن الاعتماد عليها لوضع علامة على المفصلية (ق) من الفائدة. مجموعة متنوعة من المواد (على سبيل المثال، والدهانات والأصباغ والأتربة الملونة، والعلامات، والعناصر النادرة، البروتينات) وقد استخدمت للاحتفال المفصليات لتقييم ديناميات السكان، وتشتيت قدراته، والتغذية والسلوكيات، والتفاعلات البيئية الأخرى 1،2.
ومدى ملاءمة علامة تستخدم لتفريق أي ب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الأقسام الداخلية، الاحتفاظ، والكشف الداخلي
- الإجراء بمناسبة الداخلي
- جمع الحشرات من الفائدة (ن ≈ 100 فرد) من مستعمرة المختبر تربى على النظام الغذائي الاصطناعي أو من الميدان وتقسم إلى حاويتين تربية نظيفة.
- وضع حزمة العادية 20 مل نظام غذائي (لا تحمل علامات علاج المراقبة السلبية) في واحدة من الحاويات. تكملة 20 مل علبة النظام الغذائي الاصطناعي الثانية مع 1.0 مل من 1.0 ملغ / مل الدجاج مفتش / IGY ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الداخلية بمناسبة:
وأظهرت نتائج الاختبار الداخلي الاحتفاظ علامة في الشكل 2A. كانت محسوبة ELISA قيمة العتبة الحرجة 0.054. عموما (جميع التواريخ عينة أربعة مجتمعة)، والحشرات علاجها بدون بروتين أسفرت القيم المنخفضة باستمرار ELISA (X = 0.038 ± 0.002، ن = 80). على العكس، كل من الحشرات تتغذى على البروتين المخصب أس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد وصفت الإجراء immunomarking البروتين المفصلية أول ما يقرب من ربع قرن منذ 9. منذ ذلك الحين، تم تكييفها الإجراء لدراسة أنماط تشتت تشكيلة واسعة من المفصليات باستخدام تدار داخليا وخارجيا مفتش / IgYs. وقد أثبتت هذه البروتينات علامات ثابتة لمجموعة واسعة من أنواع الحشرات اختبار حتى الآن. لكن، وكما ذكر أعلاه، فإن القيود الرئيسية لاستخدام مفتش / IgYs هي أنها مكلفة للغاية. ونتيجة لذلك، مفتش / IgYs لا تصلح إلا لMRR ودراسات النوع علامات النفس حيث يمكن أن تكون علامة دفعات كبيرة م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو فقط لغرض توفير معلومات محددة، ولا يعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة الأمريكية. USDA هو مزود تكافؤ الفرص والعمل.
شكر وتقدير
تم توفير التمويل من قبل وزارة الزراعة الأميركية كريس 5347-22620-021-00D و، في جزء منه، من قبل الزراعة والأغذية بحوث مبادرة التنافسية منحة لا. 2011-67009-30141 من المعهد الوطني USDA الأغذية والزراعة. ونحن ممتنون للدعم الفني للجوانا ناصيف. كما نشكر بول بيكر، ديفيد هورتون، دييغو نييتو، وفرانسيس Sivakoff لتوفير بعض الصور المستخدمة في الشكل (3).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حاوية تخزين المواد الغذائية (لتربية الحشرات) | Rubbermaid / Tupperware | أحجام مختلفة | مختلف المصنعين والبائعين. يتم لصق النسيج الشبكي في نافذة |
| البخاخات صغيرة الحجم (ضباب صغير) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | متوفر عبر الإنترنت وفي متاجر المستلزمات الطبية. ستعمل العلامات التجارية الأخرى أيضا. |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 1.6 مل مع غطاء | منتجات مختبر كونتيننتال | 4445.X | أي نوع مماثل سيعمل. نحن نفضل العلامات التجارية التي يسهل فتح الأغطية. |
| صندوق تخزين الستايروفوم لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة (شبكة 5 × 20) RPI | Corp. | 145746 | هذا التصميم جميل لأنه لا يزدحم الأنابيب. |
| موزع ، مكرر | Eppendorf | 4982000322 | أي شيء مشابه سيساعد في تسريع الاستغناء. |
| المدقة ، مطاحن المناديل البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة ، 1.5 مل | Kimble Chase | 749521-1500 | متوفرة مع العديد من البائعين. يمكن تنظيف المدقة وتعقيمها لإعادة استخدامها. |
| ألواح BD Falcon ELISA ، 96 بئر (قاع مسطح) | BD | 351172 | |
| ماصة Ovation ، يدوية (20-200 وميكرو ؛ ل) | VistaLab | 1057-0200 أو 1070-0200 | أي نوع مماثل سيعمل. هذا النموذج مريح. |
| الخزانات ، الكاشف المعقم | VistaLab | 4054-1000 | أي شيء مشابه سيعمل. |
| ماصة إلكترونية ، 8 قنوات (50-1،200 وميكرو ؛ ل) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | إذا كان عليك اختيار نموذج إلكتروني واحد ، فهذا الحجم هو الأكثر فائدة. |
| ماصة إلكترونية ، 8 قنوات (10-300 & micro ؛ ل) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | أي شيء مشابه سينجح. |
| مشعب ، غسالة لوحة متعددة الآبار (8 أوضاع ، مستقيمة) | Sigma-Aldrich | Z369802 | أي شيء مشابه سيعمل مع غسل الألواح يدويا. |
| قارئ صفيحة دقيقة مع الكشف عن الامتصاص | الأجهزة الجزيئية | SpectraMax 250 | أي شيء مشابه سيعمل. |
| دجاج IgG / IgY | الولايات المتحدة البيولوجية | I1903-15R | متوفر أيضا من مصادر أخرى |
| متجر بقالة | بياض | البيض " جميع البيض", " مضارب البيض" ، <م > وما إلى ذلك < / م > | امزج 5 مل مع 95 مل من الكثافة العميقة < الفرعية >2 < / فرعية > O لمحلول 5 ٪ |
| تريس (قاعدة تريزما ) | سيجما ألدريتش | T1503 | 2.42 جم / لتر لصنع كلوريد |
| الصوديوم TBS (كلوريد الصوديوم ) | سيجما ألدريتش | S9888 | 29.22 جم / لتر لصنع TBS و 8.0 & nbsp ؛ g/ L ل PBS |
| ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (Na2< / sub>HPO4< / sub>) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 جم / لتر لفوسفات |
| البوتاسيوم أحادي القاعدة PBS (KH2< / sub>PO4< / sub>) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 جم / لتر |
| لكلوريد البوتاسيوم PBS (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 جم / لتر ل PBS |
| Tween 20 ، درجة | EIA Sigma-Aldrich | P1379 | أضف 0.5 مل لكل لتر إلى PBS بعد إذابة الأملاح. |
| PBS مع 1٪ BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | امزج عبوة واحدة في 1 لتر dH2< / sub>O |
| المضاد للدجاج IgY (IgG) (جزيء كامل) أنتج في الأرانب (1: 500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 & micro ؛ ل في 50 مل ملعقة كبيرة |
| حليب جاف أو حليب مجفف أو طازج (1٪) | بقالة | امزج 10 جم مع 1 لتر dH2< / sub>O لمحلول 1٪ | |
| أجسام مضادة للدجاج IgY (IgG) (جزيء كامل) - أجسام مضادة للبيروكسيداز المنتجة في الأرانب (1: 10،000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 & micro ؛ ل في 1 لتر من 1٪ حليب |
| مضاد لألبومين بيض الدجاج ينتج في الأرانب (1: 8،000) | سيجما ألدريتش | C6534 | تمييع 125 وميكرو ؛ ل في 1 لتر PBS-BSA |
| الماعز المضاد للأرانب IgG بيروكسيداز مترافق (1: 2،000) | سيجما ألدريتش | A6154 | تمييع 0.5 مل في 1 لتر PBS-BSA ، ثم أضف 1.3 & nbsp ؛ مل Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) سيليكون بوليفور بوليمر | Lehle Seeds | VIS-01 | أضف كمكون أخير |
| TMB Microwell مكون واحد من الركيزة بيروكسيداز | SurModics | TMBW-1000-01 |
المراجع
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
