قرار الكمي عال من بلوري السليلوز تراكم في<em> نبات الأرابيدوبسيس</em> جذور لرصد الأنسجة محددة جدار الخلية تعديلات
Summary
Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.
Abstract
Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.
Introduction
جدار الخلية النباتية هو بنية ديناميكية. ويحيط نمو الخلايا بجدار الخلية الأولية، وتنظيم التي تمكن خلايا لتوسيع. الخلايا التي تتوقف عن النمو إيداع جدار الثانوي أكثر جمودا أن يعزز الدعم الميكانيكي للمصنع. وتتكون كل من جدران الخلايا من السليلوز microfibrils جزءا لا يتجزأ من مصفوفة من السكريات هياكل مختلفة (على سبيل المثال، هيميسيلولوز والبكتين) التي تختلف باختلاف المرحلة التنموية المختلفة والأنسجة 1،2. ويتم تصنيع السليلوز كما سلاسل من (1،4) -β-D-جلوكان التي تتماشى بإحكام لتشكيل لييف مكروي من البنية البلورية. يشير السليلوز غير متبلور إلى المناطق التي هي أقل أمر سلاسل جلوكان. النسبة بين البلورية وغير متبلور المجالات هي معلمة واحدة يعتقد أنها تؤثر على الخواص الميكانيكية للجدار الخلية، من خلال توفير القوة الميكانيكية ومميزة اللزجة، على التوالي 3. وكانت العديد من الطرقوضعت لكشف وتحديد هذين الشكلين من ترتيب السليلوز، من بينها حيود الأشعة السينية والاستقطاب عبر / زاوية السحرية الغزل NMR الحالة الصلبة (4). حيود الأشعة السينية يمكن استخدامها لتحديد نسبة البلورية مقابل المجالات السليلوز غير متبلور في العينة 5. يستخدم أسلوب بديل تجزئة محتوى جدار الخلية إلى مواد غير قابلة للذوبان حمض وحمض القابلة للذوبان، للتمييز بين البلورية والسليلوز غير متبلور أو البوليمرات الأخرى، على التوالي. في هذا النهج، ويستخدم إدماج الجلوكوز المسمى ([14 C] الجلوكوز) لقياس 6،7 السليلوز. تتطلب هذه الأساليب كميات كبيرة من المواد النباتية لتحليل الجهاز كله، في أحسن الأحوال، وبالتالي، هي حساسة بشكل كاف لاختلاف الأنسجة محددة في هيكل جدار الخلية. تصور microfibrils السليلوز في قرار الخلوية يمكن أن يتحقق في دراسات التصوير الحية جنبا إلى جنب مع الأصباغ الفلورية 8،9، التي يمكن أن تحدد التغييرات فيتوجه microfibrils السليلوز. ومع ذلك، لا يتم استخدام هذه الأصباغ لتقدير، فهي ليست محددة لالبلورية السليلوز وقد تتداخل مع الهيكل الطبيعي للجدار الخلية 8. Polscope هو تقنية تصوير تعتمد على قدرة السليلوز البلورية لتقسيم أشعة الضوء وتؤخر جزء من ضوء 10. التخلف الضوئية هي أقوى لmicrofibrils التي تقع عموديا على اتجاه انتشار الضوء. لmicrofibrils مع توجه مماثل، وارتفاع درجة تبلور، أكبر ريتاردانس الخفيف 11. وبالتالي، يتم استخدام polscope لدراسة كل المستويات النسبية وتوجيه microfibrils السليلوز.
جذور المعرض النمو الخطي، خلال الخلايا التي تنتج في الخلايا الجذعية المتخصصة، في غيض من الجذر، والخضوع لسلسلة من الانقسامات الخلوية، قبل أن التوسع بسرعة 12. الخلايا التي تشكل جذور توسع في اتجاه واحد (متباين الخواص)الطريقة، وفقا لما تمليه جزيء يشير الهرمونات الصغيرة التي تؤثر على خصائص جدار الخلية 13. ردود الأفعال المختلفة للهرمونات، في الزمان والمكان، وتوفير وسيلة لضمان نمو متوازن الجهاز 14. وبالتالي، تحليل دقة عالية من هيكل جدار الخلية يمكن أن توفر معلومات هامة وضرورية لفهم أفضل للعلاقة بين الاستجابات نوع معين الخلية لنمو الجهاز كله. هنا، نحن تقرير تنفيذ polscope لدراسة تراكم الأنسجة محددة من السليلوز البلورية في جذور نبات الأرابيدوبسيس، كما لوحظ في أقسام التشريحية جودة عالية. هذه الطريقة كشفت مؤخرا نوع معين الخلية تراكم السليلوز البلورية ردا على اضطراب المكاني للنشاط الهرموني 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، فإننا نقدم وسيلة لتحديد تراكم السليلوز البلورية في الأنسجة المختلفة تتكون جذور نبات الأرابيدوبسيس، مع الحفاظ على المعلومات التشريحية. على هذا النحو، فإنه يوفر خطوة إضافية نحو فهم عمليات النمو في النباتات في قرار الخلوية. هذه الطريقة يمكن تطبيقها أيضا لدر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).
Materials
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).
- Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. Growth control and cell wall signaling in plants. Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).
- Mazeau, K., Heux, L. Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose. J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).
- Zhao, H., et al. Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis. Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).
- Fujita, M., et al. Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis. Plant J. 66, 915-928 (2011).
- Peng, F., et al. Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves. Bioresources. 7, (2012).
- Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots. Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).
- Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).
- Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie. J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).
- Abraham, Y., Elbaum, R. Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy. New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).
- Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. Control of Arabidopsis root development. Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).
- Vanstraelen, M., Benkova, E. Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development. Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).
- Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. Growth control: brassinosteroid activity gets context. J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).
- Fridman, Y., et al. Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells. Genes Dev. 28, 912-920 (2014).
- Vragovic, K., et al. Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).
- Hacham, Y., et al. Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size. Development. 138, 839-848 (2011).
- Gu, Y., et al. Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).
- Fendrych, M., et al. Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis. Curr Biol. 24, 931-940 (2014).
