Introduction
דופן תא הצמח היא מבנה דינמי. תאי גידול מוקפים חומת תא ראשונית, ארגון אשר מאפשרת לתאים להרחיב. תאים אשר מפסיקים לגדול פיקדון קיר משני נוקשה יותר זה משפר את התמיכה המכאנית של הצמח. קירות תא שניהם מורכבים מיקרופיברילות תאית משוקעת בתוך גוש של סוכרים של מבנים שונים (למשל, hemicellulose ופקטין) המשתנים בהתאם לשלב ההתפתחותי השונה ורקמות 1,2. תאית הוא מסונתז כמו שרשראות של (1,4) -β-D-גלוקן כי מיושרים בחוזקה כדי ליצור את מיקרופיברילות של מבנה גבישי. תאית אמורפיים מתייחס באזורים שבהם רשתות גלוקן פחות מסודרות. היחס בין הגבישים ואת תחומי אמורפי הוא פרמטר אחד חשב להשפיע על התכונות המכאניות של דופן התא, על ידי מתן כוח מכאני מאפיין viscoelastic, בהתאמה 3. כמה שיטות כברפתח על מנת לזהות ולכמת שתי צורות של הסדר תאי, ביניהם עקיף של קרני רנטגן, קיטוב צלב / זווית קסם ספינינג NMR 4-המצב מוצק. קרן ה- X עקיף יכול לשמש כדי לקבוע את שיעור גבישים לעומת תחומים תאיים אמורפי במדגם 5. שיטה חלופית משתמשת חלוקה של תוכן דופן תא לחומר חומצה-מסיס וחומצה מסיסה, להבחין בין הגבישים ו התאי אמורפי או פולימרים אחרים, בהתאמה. לפי גישה זו, שילוב של גלוקוז שכותרתו ([14 C] גלוקוז) משמש לכמת את 6,7 התאית. שיטות אלו דורשים כמויות גדולות של חומר צמחי עבור ניתוחים איבר שלם, במקרה הטוב, ומכאן, רגישים במידה מספקת כדי וריאציה רקמות ספציפיות במבנה דופן התא. ויזואליזציה של מיקרופיברילות התאית ברזולוציה הסלולר ניתן להשיג במחקרי הדמיה חיה בשילוב עם צבעי ניאון 8,9, שיכול לזהות שינוייםאת הכיוון של מיקרופיברילות התאית. עם זאת, צבעים אלה אינם משמשים כימות, הם אינם ספציפיים צחים תאיים ועלולים להפריע במבנה הרגיל של תא הקיר 8. Polscope היא טכניקת הדמיה המסתמכת על היכולת של תאית גבישים לפצל קרן אור ולעכב חלק 10 האור. פיגור אור הוא חזק ביותר עבור מיקרופיברילות העומדים בניצב לכיוון התקדמות אור. לקבלת מיקרופיברילות עם אוריינטציה דומה, גבוה יותר את מידת crystallinity, גדול יותר retardance אור 11. לפיכך, polscope משמש ללמוד הוא את הרמות היחסיות וכיוון של מיקרופיברילות התאית.
שורשים להפגין צמיחה ליניארית, שבמהלכו תאים שמקורם בבית נישת תאי גזע, על קצה השורש, לעבור סדרה של חלוקות תא, לפני שהם להרחיב במהירות 12. התאים המרכיבים את השורש להרחיב בתוך חד כיווני (איזוטרופי)באופן, המוכתבים על ידי הורמוני איתות מולקולה קטנים להשפיע על המאפיינים של דופן התא 13. תגובות דיפרנציאלי להורמונים, בזמן ובמרחב, לספק אמצעי להבטחת צמיחת איבר מאוזן 14. לפיכך, ניתוח ברזולוציה גבוה של מבנה דופן תא יכול לספק מידע חשוב צורך להבין טוב יותר את הקשר בין תגובות סוג התא ספציפי לצמיחת איבר שלמה. כאן אנו מדווחים יישום polscope ללמוד הצטברות ספציפי רקמות של תאית גבישים בשורשי ארבידופסיס, כפי שנצפה בסעיפים אנטומיים באיכות גבוהה. שיטה זו חשפה לאחרונה תא הצטברות סוג ספציפי של תאית גבישים בתגובת הפרעות המרחבית של פעילות הורמונלית 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צמח צמיחה
- משטח לעקר זרעים.
- לעקר זרעים (עד 30 מ"ג) על ידי שיטה רטובה או יבשה. כדוגמה, עבור שיטת עיקור יבש, מוסיפים 1 מ"ל קרחונים HCl 37% ב 50 מ"ל אקונומיקה, בכוס זכוכית ייבוש סגור לפחות 4 שעות ועד לילה. בצע פעולה זו במנדף כימי.
- מורחים את הזרעים סטרילית על צלחות עם אגר צמח 0.8% ב 0.5x Murashige & Skoog (MS) בינוני. גלישת צלחות עם Parafilm או קלטת נקבובי ומכסים ברדיד אלומיניום.
- אחסן את הצלחות ב 4 ° C. עבור 1 - 4 ימים כדי לקדם נביטה אחידה.
- מעביר את צלחות חדרי צמיחה מתאימים לגידול שתילים ארבידופסיס. מניחים את הצלחות אנכית כדי לשמור על צמיחה שורש על גבי המדיום אגר ולמנוע חדירה.
- שתילי העברה קוֹבֵעַ 7 ימים לאחר הנביטה (DAG).
קיבוע 2.
- כן 50 מיליליטר ריצ'רדסון solution על ידי שילוב כמויות שווות של 1 בורקס% (סוכן חיץ), 1% מתילן כחול 1% Azure (צבעי היסטולוגית) במים מזוקקים פעמים. סינון דרך מזרק מונע 0.22 מיקרומטר יחידת מסנן PVDF לפני השימוש.
- הכן 50 מ"ל של מקבע: 1.25% Glutaraldehyde ב 0.05 M נתרן Cacodylate (סוכן חציצה).
הערה: חומרים אלה רעילים ויש לטפל במנדף כימי. - הוספת 100 μl של פתרון ריצ'רדסון (ראה 2.1) לפתרון קיבעון (ראה 2.2) כדי לקבל את פתרון קיבעון הסופי.
- מארק היטב בכל צלחת 6-היטב עם שם המדגם המקביל.
- מניחים 3 - 2 מ"ל פתרון קיבעון הסופי (ראה 2.3) לתוך הבארות, כך שתילים, הועבר פעם, יכוסו באופן מלא בנוזל.
- להעביר בזהירות, באמצעות מלקחיים, עד 10 שתילים היטב כל אחד. חותם את הצלחות באמצעות Parafilm. חנות ב 4 ° C, בחושך, לפחות לילה אחד, עד שבוע.
התייבשות 3.
- <li> מייבשי שתילים. ולהעבירם בין הבארות של 6 צלחות באר חדשות, המכילים ריכוז גדל והולך של אתנול, כמפורט כאן: אתנול 10% במשך 15 דקות; 30% אתנול במשך 15 דקות; 50% אתנול במשך 15 דקות; 70% אתנול במשך 15 דקות; 85% אתנול במשך 15 דקות; 95% אתנול במשך 15 דקות; אתנול 95% ב 4 ° C, לילה, לכל הפחות. טפל שתילים ידי אחיזה אותם בקפידה על ידי cotyledons שלהם, העדיף עם מלקחי פלסטיק.
4. הסתננות
- כן בינוני חדיר. מערבבים את התוכן של 1 שקית של מפעיל ערכת historesin עם 50 ערכת נוזל שרף בסיסי מ"ל בבקבוק זכוכית קטן. מערבבים עם מגנט עבור 20 דקות. מדיום הסתננות נשמר ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
- מארק היטב בכל צלחת 6-באר חדשה עם השם מדגם המקביל ולמלא עם 2 - 3 מ"ל של מדיום הסתננות.
- מעביר את השתילים מפתרון אתנול 95% עד הבינוני החדיר באמצעות מלקחיים. ודא את השתילים הם פוlly מכוסה על ידי המדיום.
- חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים לפחות, כדי להבטיח חדירה מקסימלית לתוך רקמות הצמח.
5. הכנת בלוק
- מניח תוויות קטנות, עפרונות המסומנות שם מדגם, בתוך היטב בכל הטבעת תבניות.
- הכן הטבעה בינוני על ידי הוספת המקשה 1 מ"ל ל 15 מ"ל בינוני חדירה (ראה 4.1). אל תנסה להכין נפח קטן יותר מ -15 מ"ל, כדי למנוע בעיות פילמור.
- מלאו חצי היטב כל העובש עם 200 μl הטבעה בינוניים ומכסי חתיכת סרט תקורה לחתוך את צורת העובש, אלא בגודל 1 מ"מ גדול יותר בכל צד. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות 2, כדי לאפשר פילמור. אינו עולה על 5 שעות.
- הכן יצוו נוסף של הטבעה בינונית (ראה 5.2) ולשמור על קרח, כדי למנוע פילמור בעוד טיפי שורש שמתבצעים מסודרים העובש.
- חותכים כל קצה השורש תחת בהיקף לנתח באמצעות אזמל בזהירות רבה העמדה שאני t: אנכי עבור סעיפים רוחביים או אופקי עבור חתך לאורך, בסביבות 2 - 3 מ"מ מפריפרית העובש. ממלא את התבנית לחלוטין עם פתרון חסימה ומכסי סרט תקורה. ראוי לציין, כי הפתרון החוסם יתכווץ מעט לאחר שהוא polymerized.
- לשמור בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות, לכל הפחות.
- כדי לייבש את אבני, למקם בתוך קופסה עם ג'ל סיליקה יבש ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך הלילה, לכל הפחות.
6. חתך
- כן סכיני זכוכית מוטות זכוכית עם מתקן להכנת סכין. השתמש סכיני הזכוכית עבור חתך רקמות. חותך את מוט הזכוכית לריבוע ולאחר מכן לחתוך את הכיכר באלכסון כדי לייצר שני סכינים, באמצעות כלי ניקוד יהלומים.
- בלוקי סעיף לתוך 2 - 3 מיקרומטר פרוסות רוחב, באמצעות מכונת חתך. פרוסות מקום בשקופית זכוכית, על גבי טיפות מים מזוקקים במקום להחליק על גוש חום מוגדר אש נמוכה (50 - 60 מעלות צלזיוס), עד מים מתאדים.
התחת = "jove_title"> 7. חלק כנה מיקרוסקופ Polarized
- לדלל פתרון ריצ'רדסון (ראה 2.1) ל -0.2% מהפתרון המקורי ולהשתמש 1 מ"ל של זה כדי לכסות את פרוסות. מניח על הגוש החום למשך 5 שניות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים.
- יבש את השקופית על פלטה חשמלית. שימו לב תחת בהיקף לנתח ולסמן האחורי של השקופית עם סמן, כדי לציין את המיקום של פרוסות של עניין, כדי להקל על זיהוי מאוחר יותר שלהם תחת מיקרוסקופ.
- הוספת 100 μl של בינוניים כיסוי גוברים עם להחליק את מכסה.
8. Image Acquisition
- מניח את שקף המכוסה המכיל את סעיפי השורש תחת מיקרוסקופ אור מצוידת במערכת Polscope מתאימה לקבל מידע retardance ומסנן אופטי מקטב / הפרעה (AD איור 1).
- הגדלה בחר המאפשר ויזואליזציה ברורה מכלל המדגם (למשל, 40X במחקר זה) ולמקד את microscopדואר על שדה ריק המכיל סעיף לחסום אבל לא בקטע שורש. נסה למצוא באזור נקי ללא פגמים. השתמש באזור זה כדי להגדיר את הרקע.
- הגדר את מערכת הדמיה ופרמטרים תוכנה: מגוון הגדר עד 17 ננומטר. החל "חשיפה אוטומטית" ולקבל תמונת רקע מהתחום הריק (ראה 8.2). תמונת רקע אחד משמשת לכל ניסוי.
9. ניתוח Polscope של כיווניות התאיות מיקרופיברילות
- ניתוח סעיפים אורכים.
- מקום שקופיות המכילות סעיפים אורכים מתחת למיקרוסקופ לקבל תמונת retardance ממנו. פוקוס מיקרוסקופ על קטע של עניין שורש. תן שם קובץ חדש.
- צילום תמונת abrio (תמונה עם מידע פיגור) דרך החלון "Abrio החי". הקפד ללכוד קטע זה כולל את דופן התא, אשר ניתן לזהות על ידי תאית מוכתם רץ לאורך בפריפריה של התא, כפי שמוצג באיור 2C.
- ניתוח תמונה.
- לחץ פעמיים על התמונה הרלוונטית בערימה תמונה. בחר "צבע כיווניות פסאודו" בלשונית "הגדרות תצוגה".
- כדי להעריך את הזווית התאית מיקרופיברילות, להתאים את הגוון מקביל דופן תא לזה של גלגל הצבעים.
הערה: גלגל הצבעים באיור 2C משקף את הציר האיטי של אור שוכב לאורך מיקרופיברילות המצביע על הכיוון לאורך ציר זמן של מיקרופיברילות. הזווית של מיקרופיברילות התאית היא הזווית שצוינה על ידי הצבע ואת ציר זמן של התא. לדוגמה, בתא מתארך ב הבלעה מראה צבע ציאן, מוטה על ידי כ -90 ° לציר הארוך של התאים. - כדי לכמת את זווית מיקרופיברילות הממוצעת בקיר התא, השתמש "retardance ו אזימוט בול" כלי מסרגל הכלים של התוכנה. בעת בחירת הכלי, הצבע ולחץ על האזור של עניין בתמונה מתקבלת.
הערה: wil זהתוצאת l בתצוגה של הזוויות (אזימוט) במעלות (איור 2 ג). - בשנת תוכנת ניתוח תמונת אור מקוטב גישה פתוחה חלופית, צהריים "Pol-Analyzer" תוסף מתפריט התוסף. בחלון החדש שנפתח, בחר את הכרטיסייה "שבירה כפולה" ופתוח ולאחר מכן שמור את הקובץ הרקע ואת קובץ התמונה.
- בחלון התמונה, בחר "מפרט." ולהתאים את 'גודל ROI פיקסל' (שימוש 5 פיקסלים למחקר זה). ב "המפרט". חלון, בחרו "צג ערכים בטבלת תוצאה".
- השתמש בכלי מצולע כדי לסמן את האזור של עניין בחלון התמונה. בחר "קווי התמצאות" כדי להשיג את הכיוון של מיקרופיברילות התאית.
הערה: זה יגרום התצוגה של זוויות (אזימוט) במעלות.
הערה: הזווית הממוצעת מחושבת על ידי אחת משתי השיטות צריכה להיות מנורמלת אז למיצובה של סעיף השורש לאורך השקופית. כדי לתקן את הסטייההמיצוב האופקי של סעיף השורש השלם לאורך השקופית, לכמת את זווית מיקרופיברילות הממוצעת של דופן תא איגוף התא לאורך הציר הארוך שלה (כלומר, בניצב הסעיף ולאורך ציר צמיחת שורש, איור 2C). זווית זו היא 180 ° כאשר סעיף השורש ממוצבת בצורה מדויקת לאורך השקופית. לצורך חישוב זווית מיקרופיברילות, להפחית את זווית מיקרופיברילות נמדד ממוצע של דופן תא האיגוף מ -180 °. מוסיפים את הפער נבע לזווית מיקרופיברילות נמדד הממוצע של דופן התא שנמצאת שטוח בשקופית.
10. ניתוח Polscope של גבישי תאית הצטברות
- השתמש בסעיפים הרוחביים (צלב). שים לב הצטברות גבישי תאית ניתן להשוות רק בין תאים כאשר מיקרופיברילות התאית שלהם מיושרות בזווית דומה (כפי שנקבעה 9).
- לחץ פעמיים על התמונה הרלוונטית בערימה תמונה. בחר "Pseudo צבע "" כרטיסיית הגדרות תצוגה ".
- כדי למדוד retardance. זום-אין על התמונה. בחר "אזור" ולסמן כל אזורי עניין. עבור אל הכרטיסיה "מדידות" ו "העתק ללוח" כל הערכים.
- מעביר את הנתונים ל- Excel ולחלץ מידע הנדרש (ממוצע באזור retardance). לנרמל את הנתונים.
הערה: כדי להסביר את ההבדלים בין עובי הפרוס, מבטאת את הערכים ביחס יתרון דופן תא ספציפי בשקופית. כדי לנרמל, לחלק את retardance הממוצע המתאים את דופן התא של ריבית על ידי retardance הממוצע של דופן תא שונה באותה התמונה. לדוגמא, את דופן התא החיצונית באפידרמיס הייתה מנורמלת את דופן תא בקליפת המוח הפנימית במחקרנו.
- מעביר את הנתונים ל- Excel ולחלץ מידע הנדרש (ממוצע באזור retardance). לנרמל את הנתונים.
- חזור על מדידות לפחות 3 חלקים לכל שורש, עם מינימום של 3 שורשים לדגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו בוחנים את ההשפעה של תגובות סוג התא ספציפי כדי ברסינוסטרואיד (BRS), באמצעות שורש ארבידופסיס כאיבר מודל 15-17. כאשר BRI1 קולטן BR הוא ממוקד, ברקע של מוטצית bri1, לקבוצת משנה של תאי אפידרמיס הנקראים תאים הלא שיער (איור 2 א ', ב'), זה מעכב הרחבת תא חד כיווני של תאי שכנים, ושלמי שורש צמיחה של 15. ניתוח Polscope בוצע על מנת לחשוף את המנגנון בסיסי עיכוב זה. סעיפים אורכים של השורש המתקבל סוג הבר מקווי להביע BRI1 בתאי שיער הלא בלבד, הראו נטייה דומה של מיקרופיברילות התאית (איור 2 ג, ד, והסביר כמו 9.2.3), המאפשר השוואה של ההצטברות היחסית של גבישים תאית בתאים meristematic האריכה, באמצעות חתכים שנלקחו באזורים אלה (איור 2E, F). ניתוח זה הראה correlatיון בין ביטוי BRI1 בתאים שאינם שיער וצבירה מקומית של תאית גבישים. מעקב ניסויים הראו כי עיכוב קל של synthase התאית על ידי ריכוזים נמוכים של isoxaben הוריד את רמת תאית גבישים בתאים אלה, אשר בתורו, שוחזרו חלקית עיכוב צמיחה, באמצעות קידום הרחבת תא חד כיווני ואורך שורש 15.
איור 1:. מערכת מיקרוסקופ אור מקוטב מערכת Polscope מורכבת מיקרוסקופ אור (א), מצויד במצלמה דיגיטלית CCD (B), מנתח גביש נוזלי ירוק ממוקם על גבי מקור האור שלה (ג) (ד). תוכנת Abrio שמשה לרכישת תמונה וניתוח. נא ללחוץ כאן to לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ניתוח Polscope של רכב Cell-סטריט. (א) חתך של שורש ארבידופסיס העיקרי מראה ארגון רדיאלי של רקמות המרכיבות אותה. מבין אלה, תאים שאינם שיער אפידרמיס (N); תאי שיער (H) ואת הקליפה (C) מסומנים. בר, 10 מיקרומטר. (ב) תמונות במיקרוסקופ Confocal של שורשים להביע BRI1-GFP ממוקד תאים שאינם שיער. לבן, מכתים PI המסמן את התאים, ירוק, ביטוי BRI1-GFP. בר, 20 מיקרומטר. (C) סעיפים אורכים של שורשים המתקבלים סוג הבר מצמח להביע BRI1 בתאים שאינם שיער. הזווית של מיקרופיברילות התאית (כלומר, את הזווית בין צבע ציר תא ארוך, המשקף לציר הארוך של השורש) דומה בין שני הקווים. דופן התא איגוף התא יחד l שלהציר אונג מכותר; סימן זווית לייצג את דופן התא המוצלת נמדדת. בר, 50 מיקרומטר. (ד) כימות של זווית תאי מיקרופיברילות בקירות תא אפידרמיס. הערת ההשתנות הגבוהה של הזוויות הנוכחיות בתאי meristematic (כלומר, אזור meristematic, MZ) לעומת תאים באזור המעבר (ט"ז), כפי שמשתקף עלילת התיבה. הזווית הממוצעת תאית הדומה מיקרופיברילות בין סוג הבר וצמחים להביע BRI1 בתאים שאינם שיער מאפשרת השוואה של הצטברות תאית גבישים בתאים של אזור התפתחות המקביל שלהם. הזווית הממוצעת במדגם כל מותווה על ידי קו אדום. (EF) רוחבי שורש קטעי רקע צמח אותם, לראות במצב retardance אור. סולם צבעים מייצג retardance לאור 0 - 17 ננומטר. הסעיפים המתאימים meristem (E) ואת ההתארכות אזורית (F) מוצגים. בר, 50 מיקרומטר. דופן תא אפידרמיס החיצונית והפנימיתדופן תא בקליפת מוח מוקפת. (G) כימות ערכי retardance כפי שחושבים מתמונות polscope. הערכים באים לידי ביטוי כיחס retardance בין דופן התא החיצונית באפידרמיס ואת דופן תא בקליפת המוח הפנימית. ראוי לציין, כי בתצהיר הגבוה של תאית גבישים בתאים שאינם שיער בקווים להביע BRI1 בתאים אלה בלבד. ממוצע + SE; 40 <n <600; (**) P <0.01; (***) P <0.001 במבחן t-דו-זנבי. הדמות שאומצה שונה מ 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה לקביעת ההצטברות של תאית גבישים ברקמות השונות המרכיבות את השורשים ארבידופסיס, תוך שמירה על מידע אנטומי. ככזה, הוא מספק צעד נוסף להבנת תהליכי צמיחת צמחים ברזולוציה הסלולר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לחקר מיני צמחים נוספים ואיברים.
מספר נקודות יש לקחת בחשבון בעת יישום השיטה. הצטברות ראשית, תאית גבישים ב קטע שורש נתון ניתן להשוות בין רקמות, בקרב חלקים מן גנוטיפים שונים ובקרב טיפולים אם הכיוון של תאית מיקרופיברילות שלהם דומה. האורינטציה התאית מיקרופיברילות נקבעה בסעיף האורך המכיל פנים אחד של קיר התא 18. לפיכך, הסדרה של סעיפים אורכים, מכסה את הרקמות המובהקות של השורשים, מהשכבות החיצוניות לאלה הפנימיים ביותר, לאפשר analysהוא האורינטציה תאי מיקרופיברילות ברקמות השונות, ובשלב ההתפתחותי נתון. בדוגמא המוצגת כאן, תאי meristematic של יש האפידרמיס מגוון רחב של אורינטציות מיקרופיברילות תאיות עם זווית מיקרופיברילות תאית ממוצעת של 140 מעלות, בעוד התאים מתארכים של האפידרמיס יש מבנה מאורגן יותר, עם זווית מיקרופיברילות תאית ממוצע של 120 °. מדידות אלה היו דומות בין סוג בר המוטציה של עניין, ובכך לאפשר השוואה בטוחה של ההצטברות התאית גבישים היחסיים, בסוגי התאים המתאימים אזור התפתחותית.
שנית, השתנות הרוחב של החלקים השונים יכולות להשפיע על הרמות של retardance האור נמדדו. זה לעקוף כאן על ידי נרמול המדידות retardance הגלם של ברקמות של עניין (תאי אפידרמיס) למדידה retardance של רקמות שונות (תאים בקליפת המוח). הערכים המנורמלים arדואר משווה (ראה איור 2E-G).
לבסוף, סעיפים רוחביים לאורך השורש, ללכוד אזורי התפתחותיים שונים. זיהוי של אזורים אלה החתך חשוב לפרשנות של הנתונים. פסד של שכבת תאי כובע שורש לרוחב החיצונית בסעיף מהווה סמן אזור פשוט. באופן כללי, תאים מתחילים התרחבות המהירה שלהם כאשר תא הבכור של כובע שורש לרוחב עובר באופן מתוכן מוות של תאים, ולאחר מכן, האפידרמיס המוגן הופך הרקמה החיצונית 19.
נכון לעכשיו, שיטות המספקות מידה ברזולוציה הסלולר של היחס בין הגבישים לעומת התחומים התאיים אמורפי חסרות. אכן, זוהי גם מגבלה אחת של השיטה המוצגת כאן. עם זאת, יכולתו לתקשר ההצטברות של גבישים תאיים כשלעצמה היא התקדמות משמעותית, כמו רמות גבוהות יחסיות של תאית גבישים סבירות הופכות יותרדופן תא חזקה עם חוזק מתיחה מוגבר. פיתוח של כלים ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע את ההרכב בדיוק את דופן התא לצד התכונות המכאניות שלה עדיין מהווה אתגר עתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22 mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100 µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
- Cosgrove, D. J.
- Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. Growth control and cell wall signaling in plants. Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).
- Mazeau, K., Heux, L. Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose. J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).
- Zhao, H., et al. Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis. Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).
- Fujita, M., et al. Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis. Plant J. 66, 915-928 (2011).
- Peng, F., et al. Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves. Bioresources. 7, (2012).
- Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots. Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).
- Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).
- Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie. J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).
- Abraham, Y., Elbaum, R. Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy. New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).
- Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N.
- Vanstraelen, M., Benkova, E. Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development. Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).
- Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. Growth control: brassinosteroid activity gets context. J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).
- Fridman, Y., et al. Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells. Genes Dev. 28, 912-920 (2014).
- Vragovic, K., et al. Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).
- Hacham, Y., et al. Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size. Development. 138, 839-848 (2011).
- Gu, Y., et al. Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).
- Fendrych, M., et al. Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis. Curr Biol. 24, 931-940 (2014).
