In Situ karakterisering van gehydrateerde Eiwitten in Water door SALVI en ToF-SIMS
Summary
Dit werk geeft een protocol voor vloeistofverwerking en monsterintroductiemethode een microkanaal in situ time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie analyse van biomoleculen eiwit in een waterige oplossing.
Abstract
Dit werk toont in situ karakterisering van eiwit biomoleculen in de waterige oplossing met behulp van het systeem voor de analyse van de Liquid Vacuum Interface (SALVI) en time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie (ToF-SIMS). De fibronectine proteïnefilm werd geïmmobiliseerd op het siliciumnitride (SiN) membraan dat de SALVI detectiegebied vormt. Tijdens ToF-SIMS werden drie wijzen van analyse zoals hoge ruimtelijke resolutie massaspectrometrie, tweedimensionale (2D) beeldvorming en diepteprofilering. Massaspectra werden zowel positieve als negatieve modes verworven. Gedeïoniseerd water werd ook geanalyseerd als referentiemonster. Onze resultaten tonen aan dat de film fibronectine in water is duidelijker en sterker watercluster pieken opzichte water alleen. Karakteristieke pieken aminozuur fragmenten zijn ook waargenomen in het gehydrateerde eiwit ToF-SIMS spectra. Deze resultaten illustreren dat eiwitmolecuul adsorptie aan een oppervlak kan worden bestudeerd dynamically gebruik SALVI en ToF-SIMS in de vloeibare omgeving voor de eerste keer.
Introduction
Hydratatie is essentieel voor de structuur, conformatie 1, 2 en 3 biologische activiteit van eiwitten. Eiwitten zonder watermoleculen rondom hen niet zou hebben levensvatbare biologische activiteiten. Specifiek watermoleculen interactie met het oppervlak en inwendige structuur van eiwitten en andere toestanden van hydratatie eiwitten dergelijke interacties onderscheiden. 4 de interactie van eiwitten met vaste oppervlakken is een fundamenteel verschijnsel gevolgen nanotechnologie, biomaterialen en weefselengineering processen. Studies hebben aangetoond dat lange conformationele veranderingen kunnen optreden als een eiwit een oppervlak ontmoet. ToF-SIMS is voorzien als de techniek die het potentieel heeft om de eiwit-vaste stof grensvlak studie. 5-7 Het is belangrijk om de hydratatie van eiwitten begrijpen op vaste oppervlakken, die potentieel biedt een fundamenteel begrip van het mechanisme van hun structuur, conformatie en biologischeal activiteit.
Echter hoofdoppervlak analytische technieken zijn meestal vacuüm gebaseerde directe toepassingen voor vluchtige vloeibare studies moeilijk door de snelle verdamping van vluchtige vloeistof onder de vacuümomgeving. We ontwikkelden een vacuümcompatibel microfluïdische interface analysesysteem in de Liquid Vacuum Interface (SALVI), om directe waarneming van vloeistofoppervlakken en vloeistof-vaste stof interacties met behulp van time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie (ToF-SIMS) inschakelen. 8- 11 de unieke aspecten zijn: 1) het detectievenster is mazen van 2-3 urn diameter worden directe beeldvorming van het vloeistofoppervlak, 2) oppervlaktespanning wordt gebruikt om de vloeistof binnen de opening te houden, en 3) is SALVI draagbare tussen meerdere analytische platforms. 11,12
SALVI bestaat uit een siliciumnitride (SiN) Membraan het detectiegebied en een microkanaal van polydimethylsiloxaan (PDMS). Het is fabrvoor bestemde in de clean room, de fabricage en uitgangspunten van factoren zijn beschreven in eerdere artikelen en octrooien. 8-12 De toepassingen van ToF-SIMS als analytisch hulpmiddel aangetoond met verschillende waterige oplossingen en complexe vloeistofmengsels sommige die nanodeeltjes bevatten. 13-17 Specifiek SALVI vloeistof ToF-SIMS maakt dynamische sonderen van de vloeistof-vaste stof grensvlak van levende biologische systemen (dat wil zeggen, biofilms), enkele cellen en vaste elektrolyt-interface, het openen van nieuwe mogelijkheden voor in situ gecondenseerde fase studies met inbegrip van vloeistoffen met behulp van ToF-SIMS. Echter, het huidige ontwerp nog niet toestaan dat gas-vloeistof interacties. Dit is een richting voor toekomstige ontwikkeling. SALVI is gebruikt om de gehydrateerde proteïnefilm bestuderen dit werk voor het eerst.
Fibronectine is een veelgebruikte eiwit dimeer bestaande uit twee vrijwel identieke monomeren verbonden door een paar disulfidebindingen, 18 waarbij is bekend om zijn vermogen om cellen te binden. 19,20 werd gekozen als modelsysteem om te illustreren dat het gehydrateerde eiwit film dynamisch kunnen worden gesondeerd met behulp van de vloeistof SALVI ToF-SIMS aanpak. De eiwitoplossing werd in de microkanaal. Na incubatie gedurende 12 uur, een gehydrateerde eiwit gevormd op de achterzijde van de SiN membraan. Gedeïoniseerd (DI) water werd gebruikt om af te spoelen na het kanaal eiwit introductie. Informatie werd verzameld uit gehydrateerde fibronectine eiwitmoleculen in de SALVI microkanaal met behulp van dynamische ToF-SIMS. DI water werd ook bestudeerd als een controle ter vergelijking met de resultaten van gehydrateerde fibronectine dunne film. Duidelijke verschillen waargenomen tussen de gehydrateerde eiwit film en DI-water. Dit werk toont aan dat eiwit adsorptie op het oppervlak in de vloeibare milieu kan worden bestudeerd met behulp van de roman SALVI en vloeibare ToF-SIMS aanpak. De video protocol is bedoeld om technische begeleiding voor mensen die geïnteresseerd zijnin het gebruik van deze nieuwe analytische tool voor diverse toepassingen van SALVI met ToF-SIMS en onnodige fouten in liquid handling verminderen evenals ToF-SIMS data-acquisitie en analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI is een microfluïdische interface die dynamisch vloeistofoppervlak en vloeistof-vaste stof grensvlak analyse maakt van vacuüm gebaseerde instrumenten, zoals ToF-SIMS en scanning elektronenmicroscopie (SEM). Door het gebruik van kleine openingen bloot vloeistof direct in vacuüm, SALVI is geschikt voor vele fijne gefocuste spectroscopie en imaging technieken zonder enige wijziging; 22 de draagbaarheid en veelzijdigheid van microfluidics maken het een echt multimodaal imaging platform. Verschillende func…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
References
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding?. Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M. Opinion – Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).
- Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).
- Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).
- Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).
- Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , (2013).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , (2014).
- Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -. Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).
- Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26 (2), 259-267 (1981).
- Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).
- Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -. Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).
- Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).
- Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).
- Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).
- Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).
- Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. , 17-25 (2014).
