Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
Por quase 50 anos, os nematóides Caenorhabditis elegans estabeleceu-se como um modelo poderoso para estudar questões importantes no desenvolvimento, neurobiologia, evolução, interações patógeno-hospedeiro, etc. 1 A força deste modelo no estudo do desenvolvimento encontra-se em: seu ciclo de vida curta de 3 dias; a facilidade com que estes animais podem ser geneticamente alteradas; sua transparência que permite a observação de deslocamento e morfologia celular em animais vivos e seu desenvolvimento que é principalmente extra-uterina. As fases de desenvolvimento do nematóide envolvem embriogênese e quatro estágios larvais (L1 a L4), seguido por idade adulta. Durante o desenvolvimento embrionário, epidérmica morfogênese atraiu considerável atenção por sua capacidade de permitir uma melhor compreensão de como epitelial células migram como um grupo, como eles reorganizar suas junções e modificar sua morfologia individual, bem como o seu posicionamento relativo dentro de um epitélio funcional.morfogénese epidérmico é dividido em quatro fases: intercalação dorsal que consiste na reorganização das células epidérmicas dorsal, designado por hipoderme; ventral invólucro, que consiste na migração de células ventrais hipodérmicas para com a linha média ventral, assim, que encerra o embrião de uma monocamada de células epiteliais; início e alongamento final de transformação do embrião em forma de feijão em larvas vermiforme. Seguindo morfogênese, Vigia do embrião e as larvas L1 iniciar a alimentação por meio de bactérias disponíveis no seu ambiente imediato.
alongamento embrionário é, por conseguinte, uma fase tardia do desenvolvimento embrionário. Consiste na extensão do embrião ao longo do seu eixo longitudinal e uma redução do seu diâmetro transversal. Isto envolve uma modificação da forma dramática das células hipodérmicas. Alongamento é dividido em um precoce e uma fase tardia. A fase inicial começa na fase vírgula e termina quando os músculos do corpo de parede começam a contrair na fase de 1,75 vezes em wdo tipo DPI (em peso) de embriões – correspondente a embriões que são 1,75 vezes em comprimento em comparação com os embriões não alongado. Morfogênese que ocorrem nessa fase são impulsionadas principalmente pela contração de feixes de filamentos de actina (FBS) localizadas no pólo apical de células hipodérmicas que impulsionam seu alongamento ao longo do eixo antero-posterior do embrião 2. A contração dos corpos estranhos é o controle por fosforilação das cadeias de miosina-luz por três quinases LET-502 / Rock, MRCK-1 e Pak-1 5. A fase final do alongamento, começa quando os músculos do corpo de parede se tornar funcional e começar a contratação. Trata-se de sinalização mecanotransdução dos músculos do corpo de parede para as células dorsal e ventral hipodérmicas e termina quando os animais chocar 3.
Alongamento defeitos são geralmente caracterizadas por a percentagem de animais que morrem como embriões (letalidade embrionária; Emb) e aqueles prender o seu desenvolvimento como larvas L1 (fenótipo prisão larval; Lva) e ser significativamente menor do que em peso. A identificação do estágio da prisão de desenvolvimento requer observação microscópica de embriões mortos e presos Larvas 3-6.
Recentemente, foi demonstrado que vários genes, tais como o regulador de Cdc42 / Rac efector e pix-1 e Pak-1, o controlo dos processos morfogénicas durante tanto precoce e tardia de alongamento 3,7. Nós também mostrou recentemente que os processos morfogénicas diferem ao longo do eixo ântero-posterior do embrião precoce durante o alongamento 3 7. Estes resultados motivou o desenvolvimento de novas métricas destinadas especificamente às etapas de alongamento precoce ou tardia e outras de medição, permitindo a caracterização da morfologia de embriões ao longo do seu eixo ântero-posterior durante o alongamento inicial.
Estes novos métodos consistem na medição do comprimento de embriões no início e no final de alongamento precoce, bem como a largura da sua eleanúncios e caudas. 7 Dois protocolos foram também desenvolvidos para medir o comprimento das larvas recém-nascidas, sincronizados em L1 estágio 7.
Os ovos dos embriões protegê-los contra o tratamento alcalino, enquanto hipoclorito larvas, e adultos bactérias presentes no meio de cultura são dissolvidos pelo tratamento. Este tratamento é, então, utilizada para purificar embriões a partir de uma população não sincronizada contendo a maioria dos adultos bem alimentados 8. restrição alimentar é usado para sincronizar as larvas recém-nascidas. Medindo a duração dessas larvas é então usada para detectar defeitos de alongamento. Esta medição é preferido em relação à medição de larvas preso em placas de cultura, porque as larvas que eclodem a partir de embriões não totalmente alongados pode recuperar a "comprimento normal" ao alimentar mas irá manter o seu tamanho reduzido, quando preso na ausência de comida.
Aqui, apresentamos protocolos detalhados que permitem a medição da length de alongar embriões, bem como a largura da sua cabeça e cauda utilizando lapso de tempo de microscopia DIC e análise de imagem (Protocolo 1). Nós também fornecemos protocolos detalhados para medir o comprimento de larvas sincronizados usando análise de imagem (Protocolo 2) e citometria de fluxo (Protocolo 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve novas métricas para caracterizar início e fases tardias de alongamento embrionário.
Na seção 1, o passo crítico é a potencial presença de bactérias no teclado. Os embriões são hermeticamente fechado entre a almofada e a lamela durante a aquisição de imagem. Selagem a lâmina é necessário para evitar a dessecação dos animais durante a aquisição que dura mais do que duas horas. Para nosso conhecimento, nenhum dos cimentos usados para montar almo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
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