Summary
本文介绍如何注入病毒载体插入鼠标额叶皮质测试需要GPCR异形成行为检测。
Introduction
致幻剂，如LSD，裸盖菇碱和麦司卡林引起人的意识，认知和情感7-9显著的变化。无论是由遗传或药物的方法羟色胺5-HT 2A受体信号的失活会导致明显减弱，以致幻剂的行为反应在两种啮齿类动物模型3,10和人类11。虽然致幻剂结合其他受体亚型8，对5-HT 2A受体被认为是必要的这些化学物质的独特的行为活动。
II组代谢型谷氨酸受体（ 即 ，mGlu2和mGlu3）一直是相当大的注意关于致幻剂的分子机制和其底层的精神病12整体作用的目标。以前，已经显示，与mGlu2蛋白（mGlu2-KO小鼠）中不表达小鼠是不敏感的HAL的细胞和行为效应lucinogens 5。还已经提出，对5-HT 2A和mGlu2受体形成一个特定的异聚复合物，通过该血清素和谷氨酸的配体调节在活细胞中的1,2- G蛋白偶联的图案。
在结构上，跨膜结构域4和mGlu2的5异的形成中发挥基础性作用与5-HT 2A受体5。此外，进一步的研究表明，三个残基位于mGlu2的TM4的细胞内端是必要的，以形成在活细胞6对5-HT 2A -mGlu2受体heterocomplex。
基于这些发现在异源表达系统中观察到，在这里，我们描述了使用野生型mGlu2和mGlu2-KO小鼠的额皮质mGlu2 / mGlu3嵌合构建的HSV介导的表达来测试是否5-HT 2A之间异形成和mGlu2是必要的通过致幻5-HT 2A受体激动剂诱导头肌的行为。
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Protocol
注：动物养殖和关心所有程序均按照西奈山伊坎医学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行。一定要在整个过程中使用无菌手套。
1.药物和病毒制剂
- 药物研制
- 通过溶解1.35毫升100mg / ml的氯胺酮和0.75毫升20毫克/毫升甲苯噻嗪12.9毫升0.9％盐水溶液制备15.0毫升氯胺酮/赛拉嗪麻醉剂。彻底混合的解决方案。
- 病毒制剂
- 克隆mGlu2和mGlu2ΔTM4N构造成双顺反子单纯疱疹病毒（HSV）载体以下先前描述6标准协议。如前所述6,13,14包装病毒颗粒。残留的替代丙氨酸- 677 4.40，丙氨酸- 681 4.44和4.48 Ala685在mGlu2为Ser686 4.40，pH值E690 4.44和甘氨酸-694在4.48 mGlu3（HA-mGlu2ΔTM4N）先前已经6中所述。
注意：这是以前表明，嵌合构建的HA-mGlu2ΔTM4N在含有完整G蛋白依赖的信号6质膜表达。 - 在不使用时在商店病毒载体-80℃。在冰上解冻病毒载体，然后分装到10微升等分试样。对于手术过程中，保持在冰上。
- 克隆mGlu2和mGlu2ΔTM4N构造成双顺反子单纯疱疹病毒（HSV）载体以下先前描述6标准协议。如前所述6,13,14包装病毒颗粒。残留的替代丙氨酸- 677 4.40，丙氨酸- 681 4.44和4.48 Ala685在mGlu2为Ser686 4.40，pH值E690 4.44和甘氨酸-694在4.48 mGlu3（HA-mGlu2ΔTM4N）先前已经6中所述。
2.手术
- 术前准备
- 权衡鼠标和氯胺酮/甲苯噻嗪鸡尾酒的适宜剂量注入小鼠（详见1.1.1）。
- 检查小鼠，看是否正常麻醉，挤压脚和尾对疼痛的反应，如果无法引起反应，鼠标被适当麻醉。
- 从头骨的基地使用快船鼻尖剃光头鼠标。应用眼用凝胶鼠标AFterward防止小鼠的失明。
- 加载每个注射器上的立体框架。然后倾斜立体框架的每个臂的垂直部分，从而它们是从正常的10度距离。确保臂倾斜，使得针彼此面对。
- 填充用70％乙醇将针清洁每个注射器。填充针至少三次，以确保该注射器是干净的。
- 一旦针头已被清洗，通过用双蒸H 2 O填充针冲洗针一旦刷新，填写每针1.3微升双蒸H 2 O的拧在注射器的柱塞释放0.3微升双蒸H 2 O的如果水珠在针尖，小心翼翼地擦去水。如果没有散发出来的注射器，推动柱塞完全放下，然后重复注射器清洗。
- 充水后，再拉起注射器填充注射器0.5微升空气。
- 一旦空气和水的注射器，认真填写注射器用1.3微升病毒解决方案。在这点上保证在注射器中的总体积为2.8微升。再次扭动注射器的尖端释放0.3微升病毒。如果在针尖液珠，仔细拭去液体。如果没有散发出来的注射器，推动柱塞完全放下，然后重复注射器清洗。
- 手术
- 装上鼠标的立体框架，确保使头骨是水平的平调整立体框架。适用povodine碘到暴露的头皮。使用手术刀，使沿着露出剃区域内的颅骨的中线矢状切口。然后装上夹子滴定管对皮肤的切口部位，以确保头骨保持暴露。
- 使用H 2 O 2溶解掉骨膜暴露的缝线头骨。现在，前囟门和缝合线是可见的，一定要调整立体框架，以确保头骨是水平的。
- 对准前囟的注射器的针的提示和记录前囟的坐标。计算的，其中针将要插入的坐标。
- 对于延髓-Cauldal（RC）面，加1.6毫米将录制的前囟门RC坐标（+1.6从囟门）。对于背腹（DV）飞机，减去记录的DV前囟坐标（-2.4来自前囟）2.4毫米。
- 最后，对于内侧横向（ML）面，添加2.6毫米于所记录的ML囟坐标（+2.6从囟）。对于所有的坐标一定要记录左，右坐标，因为这是一个双侧注射。
- 使针到所需的坐标。标记出针将要被插入并用钻头，钻标记区域的地方。
- 用棉签无线PE走任何多余的血液或骨头碎片。
- 使针的头骨，其中针的尖端接触大脑表面。然后放下针到所需的坐标慢慢地降低他们。
- 一旦针是在所希望的坐标，慢慢地在5分钟（总共0.5微升）的过程中扭曲针0.1微升每分钟的柱塞注入注射器的内容物。
- 一旦注入已经取得了离开再过5分钟皮层注射器。
- 收盘涨/护理
- 取下鼠标皮质针稳定，慢慢地。然后从立体框架删除鼠标。
- 应用氰基丙烯酸酯（皮肤粘合剂），以从切口皮肤的基部翼片，然后用钳子抓住皮肤的护翼，并放置在一起。
- 允许氰基丙烯酸酯干燥。放在笼子里的鼠标移到一个加热垫（电热垫是，如果外科可选iCal的套装保持RT下37°C - 否则没有必要）。请务必将鼠标放在纸巾，以确保床上用品不符合手术部位。
- 取决于外科手术过程的长度，确保该小鼠是从30内麻醉 - 程序在60分钟后。手术后，将动物放置在其自己笼和监控，直到它变成返回到其室收回之前意识。没有止痛剂被用于手术后的，因为它们可通过修改一些大脑生化途径的改变我们的实验的结果。然而，动物被监控，直到它们从麻醉中恢复上手术当天，和感染和疼痛/窘迫评价体征每天后操作。
3.甩头响应试验
- 建立
- 进行所有行为测试上午10:00和下午2:00，2之间 - stereota后3天CTIC注射病毒颗粒。
- 溶解（±）-1-（2,5-二甲氧基-4-碘苯基）-2-氨基丙烷盐酸盐（DOI）到0.9％生理盐水溶液，以2.0毫克/公斤。还制备0.9％盐溶液中。
- 制备家笼（28×18×15厘米），没有任何寝具并使用三脚架，调整摄像机，使得摄像机的视图是直接上方的家笼中。
- Habituate小鼠的空间之前在实验的开始，至少4小时。
- 设置一个摄像机来记录头抽搐。
- 实验
- 所以，这是直接在一个笼子相机位置。校准相机，使整个家庭笼中的视场。
- 称重小鼠并用任一0.9％盐水或DOI的适当剂量（0.01毫升/克）腹膜内注入小鼠。注：如果鼠标的重量为25克，给予剂量为0.25毫升总体积。
- 将每个鼠标背部在他们的家笼FOR 10分钟。 10分钟后，鼠标的地方入空笼的中心和验证有在视摄像头领域无盲点。按摄像机记录。离开这个房间。
注意：鼠标移动和各种行为反应其中（。甩头，耳朵划伤等请参考补充数据表1 2007年冈萨雷斯Maeso 等为通过DOI诱导行为反应的完整列表）3，将被记录30分钟。因此，存在在视记录领域无盲点是重要的。 - 30分钟后，停在原来的家笼记录在摄像机和地点鼠标背部。重复此过程对于每个鼠标。
- 评论
- 让每个裁判审查磁带盲目鼠标的实验条件（ 即 ，头部过程中使用的药物实验抽搐或颅内注射过程中使用的病毒））。手工记录每一个甩头通过量豪特的视频。
注：头肌的定义是由鼠标（补充视频）所进行的快速摇动头部运动。 - 对于每一个鼠标，平均从盲目裁判的三个总数最终HTR响应。然后基和这些值由实验条件进行统计分析（ 即 ，t检验或方差分析）。
- 让每个裁判审查磁带盲目鼠标的实验条件（ 即 ，头部过程中使用的药物实验抽搐或颅内注射过程中使用的病毒））。手工记录每一个甩头通过量豪特的视频。
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Representative Results
以前的研究结果表明，该头部抽搐鼠行为反应被可靠和鲁棒由致幻剂引起，并且它在5-HT 2A -KO小鼠3是不存在。此外，已经表明由致幻5-HT 2A激动剂DOI和LSD引起头部抽搐反应在mGlu2-KO小鼠5被显著降低。然而，虽然以前的研究结果令人信服地证明，5-HT 2A和mGlu2被组装成在转染细胞1,2,15 体外异聚复合物，此结构布置是否表现为这样在活小鼠中仍未解决。要充分认识在mGlu2-KO小鼠额叶皮质致幻5-HT 2A受体激动剂，无论是mGlu2或mGlu2ΔTM4N表达引起的精神样作用的5-HT 2A受体-mGlu2的heterocomplex的作用，研究这是否MANIPulation调节行为。
小鼠接受双顺反子的HSV帧内额叶皮质注射表达单独绿色荧光蛋白（GFP），要么mGlu2或mGlu2ΔTM4N，或绿色荧光蛋白。首先，它证实了病毒过表达在小鼠额叶皮质mGlu2或mGlu2ΔTM4N（ 图1A和1B）。正如以前证明5，通过DOI诱导头部抽搐的行为与空载体HSV-GFP注射mGlu2-KO小鼠中不存在。值得注意的是，由致幻5-HT 2A激动剂DOI诱导头部抽搐反应在mGlu2-KO小鼠过表达mGlu2获救，但不mGlu2ΔTM4N，额叶皮层相比，在表达GFP（ 图1C）的动物看到。总之，这些研究结果表明，在额皮质中的5-HT 2A -mGlu2受体复合物是用于调节精神病样状态的关键。
图1. mGlu2表达的 mGlu2 的受体Heterocomplex。表达与5-HT 2A受体是必要的致幻通过诱导药物精神病样的行为。 （ 一 ）额叶皮层HSV介导的转基因表达的形象代表。 HSV-mGlu2，这也表达绿色荧光蛋白，注入额叶皮层，和GFP表达，免疫细胞化学，比例尺，200微米透露。 （B）中的HSV介导的转基因表达在mGlu2-KO小鼠的小鼠额叶皮层和抗mGlu2反应性通过Western印迹测定。对mGlu2受体第一抗体的特异性先前已证实了在敲除小鼠6。代谢型谷氨酸受体是形成共价连接的同二聚体的GPCR。我们测量mGlu2的免疫反应性作为单体（100 kDa）的6。 （C 等人 （2012）修改6。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充视频1.甩头响应。 （点击下载）。 CD-1野生型小鼠用2.0毫克/千克DOI注射，并置于笼（壁涂黑两个笼之间）以引发头颤搐反应（后行为引起*）。
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Discussion
连同mGlu2-KO小鼠5以前的研究结果，与mGlu2和mGlu2 / mGlu3嵌合构建的结果不形成在培养的细胞对5-HT 2A -mGlu2受体复合表明对5-HT 2A -mGlu2在异聚受体复合需要鼠标额叶皮层由LSD样致幻5-HT 2A受体激动剂诱导头部抽动行为。这种方法的一个限制是，它不会在天然组织亚细胞水平测量接近分子的接近。此外，也有应注意各种临界点。因为将小鼠用HSV病毒载体注射，即要执行的实验的时间范围是2 - 注射后4天。病毒载体的位置和表达应与初次注射后不超过4天切片脑的免疫荧光染色进行验证。小鼠中的坐标不匹配或不表达病毒载体应该可以从实验数据中排除，因为它们不表达mGlu2或mGlu2ΔTM4N。关心立体定向手术后也至关重要，因为磁头伤口不当闭合可导致感染可引起在体内实验和免疫荧光染色这两个问题。注射病毒颗粒后4 -最后，立体定向注射任何行为范式（开放场交替t检验， 等 ）后，可以，只要它是2内使用。此外，协调和表达应该通过免疫荧光确认。
该GPCR的功能均聚物和/或在活细胞中异聚现已很好地建立16-18的概念。然而，尽管取得了一些进展，还需要更多的研究来确定GPCR异聚复合物的整体动物模型19的确切作用（S）。方法，如BRET和/或FRET成像研究小动物的深部组织中的蛋白质 - 蛋白质物理接近模型可以提供手段，加强活体20 GPCR异聚的功能作用的认识。使用GPCR的HSV介导的表达任一天然的或改良的跨膜蛋白，提供在体内模型来评估的GPCR的功能和相互作用。
还需要在啮齿动物模型中进一步研究，以检查它们的部件24，以及受体内化25,26后潜在的G蛋白偶联之间21-23，结构重排的GPCR异聚的稳定性和生命时间（形成和离解）。鉴于细胞信号传导和功能的GPCR的基础性作用，它很可能是这方面的可能导致有趣的基础和翻译研究。
虽然进一步调查，需要与先前的STU定量表征在人类和小鼠的CNS两种受体的超微结构共定位，一起模具是令人信服地证明了电，蜂窝，和在小鼠模型中诱导的致幻行为反应是固有的5-HT 2A受体表达皮层锥体神经元3,27,28，这里描述利用HSV介导的表达方法获得的研究结果表明是需要由致幻5-HT 2A受体激动剂DOI诱导头部抽搐精神病样行为在小鼠额叶皮层5-HT 2A和mGlu2受体之间的异形成。
HSV介导的mGlu2的表达，但不mGlu2ΔTM4N，在mGlu2-KO小鼠的额叶皮层神经元救援由致幻5-HT 2A受体激动剂DOI感应头肌行为。这个翻译工具可能是有利的临床前研究，以评估GPCR异聚的行为表型。
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Acknowledgments
NIH R01MH084894参与这项研究的经费。我们想感谢博士。优思明赫德和斯科特·鲁索在西奈山医学院学校小鼠的捐赠，这项工作的拍摄过程中使用其手术和行为的设施。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mGlu2 bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| mGlu2ΔTM4N bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| GFP bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| Xylazine | Lloyd | List no. 4811-20ml, NADA #139-236, NDC Code(s): 61311-481-10 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ketamine | Vedco | KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC Code(s): 50989-161-06 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ophthalmic gel | Fisher Scientific | NC0550805 | |
| Burret clips | Fisher Scientific | NC9268369 | |
| Feather surgical blade | Fisher Scientific | NC9032736 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 19-898-919 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14815203 | |
| Hamilton™ Small Hub Removable Needles (33 Ga) | Fisher Scientific | 14816206 | |
| Cordless Micro Drill | Fisher Scientific | NC9089241 | |
| Dermabond Dermal Adhesive | Fisher Scientific | NC0690470 | |
| (±)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride (DOI) | Sigma-Aldrich | 42203-78-1 | Dissolved in 0.9% saline solution to the concentration of 2.0 mg/kg |
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