En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact
Summary
In questo articolo descriviamo un metodo relativamente semplice adattato utilizzando il colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) per en face rilevazione simultanea e la visualizzazione di ossido nitrico intracellulare (NO) e di anione superossido (O 2 .- ), rispettivamente, in appena isolato aortas intatte di un modello di obesità del mouse.
Abstract
ossido nitrico endotelio-derivato (NO) prodotto da endoteliale NO-sintasi (eNOS) è uno dei più importanti molecole vasoprotettive nella fisiologia cardiovascolare. Disfunzionale eNOS quali sganciamento eNOS porta alla diminuzione NO biodisponibilità e aumento anione superossido (O 2 .-) di produzione, e, a sua volta promuove malattie cardiovascolari. Pertanto, la misura appropriata di NO e O 2 .- livelli nelle cellule endoteliali sono fondamentale per la ricerca sulle malattie cardiovascolari e complicanze. A causa della natura estremamente labile di NO e O 2 .-, è difficile misurare NO e O 2 .- direttamente in un vaso sanguigno. Sono stati sviluppati numerosi metodi per misurare NO e O 2 .- produzione. È, tuttavia, sia insensibile, o non specifici, o tecnicamente impegnativo e richiede attrezzature speciali. Qui si descrive un adattamentodel metodo colorante fluorescente per en Face Detection e la visualizzazione di intracellulare NO e O 2 simultanea .- utilizzando la cellula permeabile diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE), rispettivamente in aorte intatte di un modello di obesità del mouse indotti per l'alimentazione ricca di grassi-dieta. Abbiamo potuto dimostrare diminuzione intracellulare NO e O migliorato 2 .- livelli nelle aorte intatti appena isolati di topo obesità rispetto al controllo del mouse magra. Abbiamo dimostrato che questo metodo è una tecnica semplice per la rilevazione diretta e visualizzazione di NO e O 2 .- nei vasi sanguigni intatti e può essere ampiamente applicato per l'indagine della funzione endoteliale (dis) sotto (fisio) condizioni patologiche.
Introduction
Le cellule endoteliali vascolari mantenere l'integrità strutturale e funzionale vascolare rilasciando fattori vasoattivi 1. Tra questi fattori, l'ossido di azoto endotelio-derivati (NO) prodotto da L-arginina tramite endoteliale NO-sintasi (eNOS) è il fattore più importante e meglio caratterizzato nella fisiologia cardiovascolare 2. NO provoca il rilassamento della muscolatura liscia e inibisce la proliferazione delle cellule, inibisce l'aggregazione piastrinica e l'adesione delle cellule infiammatorie e l'infiltrazione nello spazio sottoendoteliale, quindi la protezione contro lo sviluppo della malattia vascolare 3. In molte condizioni fisiologiche e patologiche, tra cui l'invecchiamento, ipertensione, diabete, iperlipidemia, ecc, disfunzione endoteliale caratterizzata da ridotta biodisponibilità di NO e aumentato O 2 .- produzione è presente e promuove la patogenesi dell'aterosclerosi 2. Gli studi degli ultimi anni dimostrano che il disaccoppiamento di eNOS è unimportante meccanismo per la disfunzione endoteliale, in cui l'enzima eNOS genera O 2 .- invece di NO, nelle varie condizioni suddette 1,4. Pertanto, l'analisi della funzione endoteliale, in particolare, endoteliali produzione di NO e O 2 .- generazione è fondamentale per la ricerca sperimentale sulle malattie cardiovascolari e complicanze.
Ci sono numerosi approcci metodologici che sono stati sviluppati per analizzare e misurare la produzione di NO in campioni biologici. A causa della natura estremamente labile di NO che viene facilmente ossidato a NO 2 – e NO 3 – con un'emivita di 3 a 6 sec, è difficile da misurare direttamente NO. Pertanto determinazione di NO 2 – / NO 3 – nei campioni di liquido è stato usato come indice di NO liberato dalle cellule o tessuti 5. Anche se la procedura è relativamente semplice, il metodo è, tuttavia, easily affetto da alta sfondo di NO stabile 2 – / NO 3 – contenuto nella soluzione. Perché NO stimola solubili della guanilato ciclasi per la produzione di guanosina monofosfato ciclico (cGMP) 6, il livello di cGMP cellulare è stato anche determinato a stimare il rilascio di NO 7. Anche in questo caso, si tratta di una stima indiretta e non può essere specifica, dal momento che alcuni fattori endotelio-derivati come il C-peptide natriuretico di tipo (CNP) potrebbe anche aumentare i livelli di cGMP attraverso l'attivazione di particolato guanilato ciclasi 8. NO è prodotto da L-arginina con generazione di L-citrullina come sottoprodotto 9, misura della produzione di L-citrullina è quindi utilizzato anche come un metodo indiretto per stimare la produzione di NO. I principali svantaggi di questo metodo sono che è radioattivo e non misura i livelli di NO bioattivi, dal momento che NO Liberatoria potrebbe essere rapidamente inattivato da O 2 .-; Inoltre, L-citrullina può essere riciclato a L-arginina 10. Altri metodi chimici come il rilevamento chemiluminescenza 11, risonanza di spin elettronico 12, o porfirinico elettrochimico NO sensore 13 sono utilizzati da molti ricercatori. Questi metodi non sono di solito facile in funzionamento, le procedure di rilevamento e richiedono attrezzature speciali. E 'anche ricordare che molti studi si applicano esperimenti bagno per organi con i vasi sanguigni isolati con o senza l'endotelio per valutare la funzione endoteliale e indirettamente misura non mediata rilassamenti vascolare endotelio-derivati. Tuttavia, questo metodo, anche se è principalmente vicino alla situazione fisiologica, ma strettamente a dire, non misura NO funzione, piuttosto valuta endotelio-mediata risposte vasomotorie in generale che riflettono effetti netti della funzione eNOS, produzione di altri derivazione endoteliale rilassante fattori e fattori contraenti endotelio-derivati, la produzione di O 2 .-, e anche le risposte delle cellule muscolari liscea questi fattori. Un'analisi specifica della funzione eNOS e la produzione di NO è di solito necessario 3.
Molti gruppi di ricerca hanno compreso il nostro, negli ultimi anni ha usato il metodo colorante fluorescente per rilevare la produzione intracellulare di NO 14-19. In questo metodo è stato utilizzato il cellulare spia permeabile fluorescenza diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) per misurare la libera funzione NO e NOS in cellule e tessuti in vitro o ex vivo vivente. Il principio è che nelle cellule viventi, DAF-2DA è deacetilata da esterasi intracellulare di non fluorescente 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) che è stato poi convertito in fluorescente DAF-2 triazolo (DAF-2T) reagendo con NO . La fluorescenza da DAF-2T può essere osservata sotto un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale a fluorescenza 14. L'intensità della fluorescenza intracellulare riflette quindi la produzione NO intracellulare nelle cellule o dell'endotelio di un intatto in vesse sanguel. In combinazione con uno specifico colorante fluorescente come dihydroethidium (DHE), si può valutare contemporaneamente intracellulare NO e O 2 .- generazione nelle cellule o nei vasi sanguigni 14. Analogamente, DHE è anche un composto cellula-permeabile che viene ossidato da O 2 .- all'interno delle cellule, e il prodotto ossidativo poi intercala con acidi nucleici per emettere un colore rosso vivo rilevabile quantitativamente mediante microscopio a fluorescenza o microscopio a fluorescenza confocale. DHE è un colorante molto specifica per il rilevamento di O 2 .- da campioni biologici, in quanto rileva essenzialmente radicali superossido, viene mantenuto bene da cellule, e può anche tollerare fissaggio lieve 20. Uno dei vantaggi di questo metodo colorante fluorescente è che rileva e visualizza NO e / o O 2 .- en face direttamente sullo strato endoteliale intatto di un vaso sanguigno vivente.
In questo documento,descriviamo questo metodo colorante fluorescente per rilevare NO e O 2 .- che abbiamo adattato per en face detection di NO e O 2 .- in aorte intatte di un modello murino di obesità indotta da alto contenuto di grassi, la dieta (HFD) di alimentazione. Abbiamo dimostrato che questo metodo potrebbe con successo e in modo affidabile misurare NO e O 2 .- livelli e valutare la funzione eNOS (dis) nello strato endoteliale di appena isolate aorte intatte mouse in obesità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rilevazione di NO o O 2 .- con coloranti fluorescenti è stato spesso usato in molti studi in cellule endoteliali in coltura e anche in tessuto criosezioni 23. Qui abbiamo esteso questo metodo per i vasi sanguigni di vita intatto, vale a dire, en face detection di NO e O 2 .- livelli nello strato endoteliale con rispettivamente DAF-2DA e DHE, che è efficace, relativamente semplice, e intuitivo. In confronto con il metodo criosezioni vasco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.
Materials
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20°C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20°C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1000X stock,stored at 4°C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl) | Sigma-aldrich | A5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health(NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| 26G×1/2ʺ syringe | Becton Dickinson | 305501 | |
| Coverslip round diam15mm | vwr | 631-1579 | |
| Tips 1 mL | vwr | RFL-1200c | |
| Tips 200 uL | vwr | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
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