RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.
RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.
Malaria er en myg-bårne smitsom sygdom, der påvirker mange millioner individer hvert år. World Health Organization (WHO) rapporterer, at i 2013 var der cirka 584 tusind dødsfald som følge af malaria, 78 procent, der fandt sted i børn under fem år 1. De patogener, der forårsager menneskelig malaria er Apicomplexan parasitter inden for slægten Plasmodium og overføres mellem deres menneskelige værter af kvindelige Anopheles myg. Transmission opstår, når myg tager en blodmel fra en person, der er inficeret, og derefter indskud infektiøse parasitter i en ikke-inficerede individ i en efterfølgende blod måltid. Inden for slægten Anopheles, malariamyg er arten med størst vektorielt kapacitet og er den mest fremtrædende malaria vektor i Afrika syd for Sahara 1-3.
I øjeblikket myg vektor kontrol indsættelse af insekticider fortsætter med at be den største metode anvendt til at mindske byrden af menneskelige malaria. Selv om anvendelsen af insekticider siden 1960'erne har vist sig at være yderst vellykket, har fremkomsten af insekticid resistens drevet et behov for udvikling af nye insekticider og alternativ vektor styringsstrategier 4-7. I løbet af 2010 er angivet i alt 49 af 63 lande, der indberettede til WHO forekomsten af insekticidresistens i malaria vektorer 1. Derudover IR Mapper værktøj, som udnytter peer-reviewed litteratur for at vurdere resistens data i Afrotropical regioner, rapporterer, at mellem 2001 og 2012 var der 46% og 27% stigninger i modstand mod pyrethroider og dichlordiphenyltrichlorethan (DDT), henholdsvis 7.
RNA-interferens (RNAi) blev identificeret i begyndelsen af 1990'erne som en teknik, der kan anvendes til at inaktivere gener i Petunia plante 8,9 og i svampen Neurospora crassa 9,10. Kort tid derefter,i 1998 blev RNAi først dokumenteret i Caenorhabditis elegans som et middel til at reducere genekspression i en dyremodel ved indføring af antisense eller dobbelt-strenget RNA (dsRNA) via injektion eller fodring metoder 9,11. Siden opdagelsen har RNAi revolutioneret udøvelse af funktionel genomforskning ved at give forskere til at udnytte revers genetik til hurtigt at undersøge de funktionelle roller gener af interesse via en meget selektiv post-transkriptionel gendæmpning mekanisme. I nogle organismer, såsom Drosophila melanogaster, har anvendelsen af transgene organismer, som udtrykker interfererende RNA-konstruktioner været bredt vellykket for gen knockdown (KD). Selv om anvendelsen af transgener i An. gambiae for RNAi er blevet udnyttet, og kan vise sig nyttig til store skærme, frembringelsen af transgene myg stammer er både arbejds- og tidskrævende, generelt tage to til tre måneder at gå fra identifikation af et gen af interesse for Generatipå en passende transgen lager 12. I øjeblikket er den primære metode til gen KD i An. gambiae er ved injektion i hæmolymfe, under voksne stadium, af dsRNA er specifik for et givet gen 12,13. Denne proces tager typisk omkring en måned at gå fra identifikation af et gen af interesse til vurdering af gen KD, viser sig at være langt hurtigere end transgene metoder 12. Fremgangsmåder til larvestadiet-fase RNAi er blevet etableret for nylig i An. gambiae og Aedes aegypti via nanopartikel fodring 14-17 eller ved oral levering af mikroalger-baserede dsRNA molekyler 18, som giver mulighed for at udføre funktionel genomisk analyse i tidlige stadier af udvikling. I direkte indsprøjtning, fodring, og nanopartikler formidlingsmetoder, er dsRNA taget op autonomt af målcellen og spaltes af enzymet Dicer i 21-25 nukleotider lange "kort interfererende RNA" (siRNAs) 19,20. Disse siRNA'er derefter incorporated ind i RNA-inducerede silencing kompleks (RISC), hvorfra en streng vil blive kasseret, hvilket tillader RNA-bundne RISC-komplekset at binde til og spalte mål-mRNA og derved reducere dens niveau og inhibere dets oversættelse 19,20.
Mange iboende træk ved grundlæggende myg biologi modulere vektorielt kapacitet, herunder vært præference (f.eks lugtesansen, gustation), parring, reproduktion og immunitet. I betragtning af betydningen af disse biologiske processer, er det sandsynligt, at deres modulation på en genetisk eller farmakologisk niveau vil give nye muligheder for vektorstyring, herunder omgåelse af insekticidresistens, og give nye værktøjer til mere bredt integrerede tilgange til vektor management. Brugen af funktionel genomforskning at vurdere roller gener bag disse iboende biologiske funktioner vil gøre det muligt at identificere nye mål og give ny indsigt i, hvordan vi effektivt kan skabe nye, mere effektiv kontrol strategerne. Vi beskriver udviklingen og anvendelsen af en hurtig injektion metode til initiering RNAi under puppestadiet af An. gambiae. Vi observerer, at puppestadiet injektion af en RNAi trigger muliggør observation af de resulterende fænotyper i fase voksne tidlige, dvs. hurtigere efter fremkomsten end man ville observeres, hvis gen knockdown blev påbegyndt hos voksne efter fremkomst. Denne metoder muliggør gen knockdown der begynder i puppe udviklingsmæssige interval og strækker sig ind voksne stadier, således at gen knockdown påbegyndt i puppe udvikling kan vare og påvirke tidligt voksne hemolymph-tilgængelige celletyper, samt celletyper, der er mere hemolymph-tilgængelige under forvandling end i den voksne, såsom sensoriske neuroner findes i voksent vedhæng følgende fremkomst.
Aktuelle metoder til at fremkalde ikke-transgen RNAi i myg involverer direkte injektion af dsRNA i den voksne hemocoel 12,13 eller larver fodring af RNAi trigger-coatede nanopartikler 14-17 eller mikroalger-baserede dsRNA molekyler 18. Målretning den voksne myg, mens yderst værdifuld, kan udelukke et stort antal gener, der fungerer under tidligere udviklingsmæssige perioder. Knockdown initieret af larvernes fodring kan give inkonsistente fænotyper i voksne stadium skyldes til dels, at potentialet i variable protein persistens gennem puppestadiet. Derfor indfører en ekstra metode, der specifikt tager sigte på at indlede RNAi i puppe udvikling vil give et middel til mere fuldt ud at vurdere gen funktioner under pre-voksne udviklingsstadier samt forbedrede evner til at vurdere gen funktion under voksne stadier. Som med gen knockdown tilgang baseret på dsRNA injektion eller udtryk, den fortsatte gen knockdownkan ikke forudsiges. Derfor bør udskrift eller protein niveauer vurderes for genet af interesse under udviklingsmæssige perioder af interesse. Selvom vi observere en fortsættelse af nedsat protein niveauer på dag 5 efter injektion for SRPN2 i SRPN2 dsRNA-injicerede dyr, kan faktorer såsom protein omsætning og halveringstid er forskellige for forskellige mål. Det er afgørende for at sikre, så godt, at dsRNA'et skal anvendes til injektion er godt koncentreret og fremstår intakt på en agarosegel. Vi anbefaler eksperimentatorer revurdere disse faktorer, hvis knockdown resultater ikke er tilstrækkelige, og de respektive koncentrationer af dsRNA kan skal testes empirisk for specifikke genmål.
Vi beskriver en fremgangsmåde til initiering af RNA-interferens under puppestadiet af An. gambiae udvikling. Denne metode bygger på introduktion via mikroinjektion af dsRNA direkte i hemocoel af tidlig pupper og muliggør vurdering af injektion kvaliteten afbrug af farvestof-mærket dsRNA. Evnen til at visualisere injektion kvalitet udgør en kritisk ekstraudstyr for at sikre en vellykket knockdown og udgør et aspekt af injektion-baserede gen knockdown, der ikke er behandlet i de fleste tidligere rapporterede dsRNA-baserede protokoller med fokus på voksne stadium. Ved at målrette puppe ved starten af denne udviklingsperiode, gener, der kunne spille en rolle i denne kritiske udviklingsmæssige interval, eller under de tidlige stadier af voksenalderen kan evalueres funktionelt. Derudover kan denne fremgangsmåde gøre det muligt dsRNA levering til celler og etablering af RNA-interferens i celler, der er tilgængelige under metamorfose, men mindre tilgængelig i fuldt dannet voksne myg.
En nylig microarray analyse af Harker et al. (2012) identificerede 560 An. gambiae transkripter, der blev opreguleret eller nedreguleret med mindst 4 gange i løbet af distinkte udviklingsstadier, lige fra embryoet til voksen. Af de 560 udskrifter identificeret, et sæt af 309 blev opreguleret i puppe udvikling 27. Disse resultater antyder, at der er mange krav til differentiel genekspression hele mosquito udvikling, herunder dem, der optræder under puppestadiet, et interval, hvorunder organismen undergår metamorfose. I mange insektarter, herunder en. gambiae, gener involveret i processer som udvikling (dvs. puppe kutikulære og chitin-bindende proteiner) 27-31 og immunrespons (dvs. Toll-receptor-lignende proteiner) 27,32-34 er stærkt til udtryk under puppestadiet. Når et fuldt dannet voksen er opstået, er der fortsat genekspression som reaktion på miljømæssige og fysiologiske ændringer 35. Især under tidlig voksen udvikling, er der en stigning i ekspressionen af udviklingsmæssige gener (dvs. voksne kutikulære og sarkoplasmiske proteiner) 36, samt andre vigtige gener (dvs. </em>, Sperm specifikt protein og cytochrom P450 metabolisme-enzymer) 27,36.
Den positive kontrol anvendes i udviklingen af denne protokol, SRPN2, er en An. gambiae serinproteaseinhibitor (serpin). SRPN2 spiller en vigtig rolle i den negative regulering af insekt melanin, et bredt spektrum medfødte immunreaktion i insekter 21,22. Knockdown af SRPN2 i voksne myg resulterer i pseudo-tumordannelse 21,22, en fænotype, der er let observeres ved brug af lysmikroskopi. I betragtning af, at dette særskilte fænotype kan let scoret i levende insekter, vi brugte SRPN2 til indledende puppestadiet RNAi injektioner. Desuden er SRPN2 udtrykt under alle udviklingsstadier 37, hvorved der tilvejebringes et godt mål for puppestadiet RNAi injektion og vurdering af funktion i de tidlige voksen. Vi viser, at den metode, vi har udviklet, er i stand til at inducere tilsvarende voksen melanotiske pseud o-tumordannelse som følge af dsRNA injektioner udført i puppe udviklingstrin. Ved udviklingen af denne protokol, har vi observeret, at injektion i den tidlige puppe udvikling (dvs. de første 24 timer efter den larvestadiet-puppe molt) er kritisk for at opnå optimal voksen fremkomsten. I tilfælde af, at dårlig fremkomsten opnås efter injektion, anbefaler vi iscenesættelse larver med større nøjagtighed, for at opnå pupper med mindre omfattende neglebånd hærdning og forsikre opnås tidligt puppestadiet injektion. Endvidere kan minimere skader på kutikula resulterer i optimale fremspiring satser og øge forstørrelsen under injektion at sikre, at kun den planlagte region af dyret er punkteret. Hvis nålen skal punktere igennem til den ventrale kutikula, vil samling af farvestof-mærkede væske være indlysende på ydersiden af puppe eller vil mætte filtrerpapir. Det anbefales stærkt at kassere pupper, der har mere end én neglebånd punktering.
jove_content "> Med de omfattende erfaringer fra mange laboratorier med udførelsen af voksne myg injektioner, kan tidligere identificerede mikroinjektion tilgange tilpasses med enkle protokol modifikationer til brug i puppe RNAi eksperimenter. Samlet er målet med denne metode er at give forskerne mulighed for at udvide tidsrammen hvorunder omvendt kan udføres genetiske analyser, yderligere muliggør forskning, som vil støtte udviklingen af nye vektor bekæmpelsesstrategier. Interessant eksperimenter i andre arter, såsom Rhodnius prolixus og Spodoptera frugiperda, afslører, at genet dæmpende virkninger tendens til at være meget større, når påbegyndt i pre-voksen iscenesætter 38,39. under alle udviklingsstadier, RNAi-medieret gen knockdown er underlagt overvejelser om hurtighed og persistens af gen-lyddæmpning, og stabiliteten af proteiner kodet af målrettede gener. den ideelle RNAi mål gener tendens til at være dem, der koder en Protein eller RNA, der har en kort halveringstid og høj omsætningshastighed 11,40.Mens transgene RNAi strategier også kan anvendes til at løse overvejelser om hurtighed og persistens af RNAi i præ-voksne stadier, transgene teknikker har mange ulemper (f.eks tid, der kræves til produktion af transgene linjer, eksperimentelle tidsrammer for myg parringer til at generere insekter med reguleret dsRNA udtryk, og vedligeholdelse af transgene lagre). Derimod vores protokol giver en lettere og hurtigere metode til at igangsætte gen knockdown under puppe udvikling og celletyper, der stammer og er tilgængelige under metamorfose, men er mindre tilgængelige hos voksne. Anvendelsen af farvestofmærkede dsRNA suspensioner tillader nem vurdering af injektion succes og spredning af indførte materiale inden pupper. Vore data om indtræden af tumordannelse i puppe-injicerede voksne, sammenlignet med dyr injiceret som voksne, er i overensstemmelse med initiation af RNAi-medieret knockdown under puppestadiet. Ved hjælp af vores G3 myg linje og under vores insektbetingelser, vi observere voksne melanotiske pseudo-tumordannelse så tidligt som 10 dage efter injektion af voksne injiceret tre til fem dage efter fremspiring. Ved at udføre puppe-stadium injektion tidligt, vi observerer synlige melanotiske pseudo-tumordannelse så tidligt som fem dage efter injektion (dvs. tre til fire dage efter fremkomsten). Disse data indebærer, at denne fremgangsmåde muliggør initiering af gen knockdown under en tidligere under-undersøgt udviklingsperiode (dvs. puppe udvikling). Vores mærkning farvestof Fremgangsmåden kan også være nyttigt for udviklingen af nye larvestadium injektionsprotokoller, på grund af det gennemskinnelige natur af kutikulaen under alle larval instars. Mens kontrolgruppen anvendt i denne undersøgelse kræver progression i voksne stadium for at vise en knockdown fænotype, at fremtidige eksperimenter vurdere puppestadiet-specifikke fænotyper efter injektion af tidlig pupper vil giveværdifuld indsigt om udvidelse af denne metode i yderligere udviklingsmæssige perioder såsom sent puppe udvikling. Sammenfattende denne metode giver en værdifuld RNAi protokol for puppestadiet initiering af RNAi-medieret gen knockdown og udvider de funktionelle genomiske værktøjer til rådighed til brug inden for vektor insekt forskningsverdenen.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.
MEGAscript RNAi kit | Ambion | AM1626 | |
Nanoject II injector | Drummond | 3-000-204 | |
Nanoject II foot switch | Drummond | 3-000-026 | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
Glass micropipette puller | Narishigne | PB-7 | |
Fast Green FCF dye | Sigma | F7258 | Can substitute with a non-toxic food dye. |
Plastic transfer pipettes | Thermo Scientific | 1371150 | ¼ inch cut from tip to create a wider opening. |
Whatman “thin” filter paper | GE Healthcare | 1001-090 | This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad. |
Western blot “thick” filter paper | BioRad | 107-3931 | This is the filter paper generally used for Western blots. |
Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Paint brush (size 0) | Michael’s Art | 10474940 | Brush size and brand can vary based on availability and user preference. |
Dissecting light microscope | —- | —– | This can vary based on availability and user preference. |