对整装斑马鱼胚胎纤毛器官中的磷酸化表位进行免疫染色

摘要

本文描述了在整只斑马鱼胚胎中对磷酸化表位进行免疫染色的技术，并进一步在小至初级纤毛的细胞结构中进行双色荧光共聚焦定位。这些固定和成像技术可用于确定特定蛋白质出现或激活的位置及其动力学特征。

摘要

细胞的快速增殖、基因的组织特异性表达以及信号网络的形成是所有脊椎动物早期胚胎发育的特征。发育中胚胎内信号的时间动力学及其空间定位——即使在单个细胞内——有助于鉴定重要的发育相关基因。本文描述了免疫染色技术，这些技术已被证实可用于定义初级纤毛等微小结构中细胞内及整体动物水平信号的动力学。利用激光扫描共聚焦复合显微镜进行样品固定、成像及图像处理的技术流程可在短短36小时内完成。

斑马鱼（Danio rerio）是一种理想的模式生物，适用于希望在与人类疾病相关且成本较低的脊椎动物中开展研究的科研人员。基因敲除或基因沉默的效果必须通过检测目标蛋白产物的实际缺失来加以确认。本方案中所述的技术可用于实现对蛋白缺失的验证。此外，利用可识别经翻译后磷酸化修饰蛋白的抗体，还可解析信号通路的相关信息。因此，保持并优化表位的磷酸化状态对于此类检测至关重要，本实验方案即旨在实现这一目标。

本研究描述了在发育的前72小时内固定胚胎的技术，并在Kupffer's Vesicle（KV）、肾脏和内耳中将多种相关表位与纤毛进行共定位。这些技术操作简便，无需解剖，可在相对较短的时间内完成。将共聚焦图像序列投影为单幅图像，是展示这些数据的有效方法。

引言

此处所述技术源于旨在确定Ca下游靶点的研究²⁺ 早期发育过程中发生的事件（包括受精、原肠胚形成、体节发生以及躯干、眼睛、大脑和器官形成）期间的信号。^1-3 胚胎Ca的最初发现²⁺ 信号传导依赖于天然和工程化Ca的使用²⁺ 指示剂，例如 aequorin⁴ 和 fura-2。⁵ 即使借助现有技术，检测细胞内钙离子（Ca²⁺）的瞬时升高仍然具有挑战性。²⁺ 需要繁琐的分析工具，且无法揭示此类Ca的作用靶点²⁺ 信号。

本实验室研究钙²⁺ 通过Ca介导的信号²⁺/一种依赖钙调蛋白的（多功能）蛋白激酶，称为CaMK-II，该酶在中枢神经系统中含量丰富，最初被鉴定为长时程增强的调节因子。⁶ CaMK-II 并非脑组织特异性蛋白，在整个动物界物种（包括无脊椎动物）的整个生命周期及全身组织中均有广泛表达且高度保守。^7,8 CaMK-II 具有在 Ca²⁺ 水平下降后仍维持自身活性的独特能力²⁺ 由于其在Thr位点具有自磷酸化能力，导致其水平下降²⁸⁷在自磷酸化状态下，CaMK-II 在 Ca²⁺/CaM非依赖性方式，直至去磷酸化。⁶ 因此，磷....

方案

本方案中的斑马鱼操作程序已获得弗吉尼亚联邦大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 试剂的准备

1. 4% PFA/PBS。在通风橱中称取8 g多聚甲醛（PFA）。仍在通风橱内，将干燥的PFA加入约80 ml蒸馏H₂O中，搅拌并加热至50 °C。持续搅拌，逐滴加入3–10滴新鲜的1N NaOH，直至PFA完全溶解且溶液变澄清。 停止加热，加入100 ml 2倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）。用蒸馏H₂O定容至200 ml 。冷却至室温 ，使用前确认pH为7.4。置于4 °C避光保存，但需在一周内使用完毕。
2. 使用不含任何添加剂的100%甲醇。使用不含任何添加剂的95%乙醇。
3. 配制含Tween的磷酸盐缓冲液（PBT）。在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入0.1% Tween-20。将0.5 ml 20% Tween-20储备液加入100 ml 1倍浓度PBS中。室温保存。
4. 配制含Triton-X的磷酸盐缓冲液（PBTx）。在PBS中加入0.1% Triton X-100。将0.5 ml 20% Triton X-100储备液加入 100 ml PBS中。室温保存。
5. 配制10% NGS/PBTx。正常山羊血清（NGS）用于封闭非特异性结合位点。将NGS分装后于-20 °C保存。使用时，取....

结果

可视化磷酸化表位的最佳条件

与通过mRNA定位的方法相比，描述斑马鱼胚胎中蛋白质表位免疫定位的方法相对较少 原位 杂交。用于定位斑马鱼胚胎纤毛细胞中蛋白质表位的固定剂包括4% PFA/PBS和Dent's固定剂，后者是甲醇与DMSO的混合物。¹⁹ 整体样本中RNA的定位 原位 杂交（WISH）通常使用多聚甲醛（PFA）固定后，保存于100%甲醇中。^20,21 我们的研究发现，当甲醇处理时间控制在2至7天时，WISH固定剂组合在使用P-CaMK-II抗体进行免疫定位方面显著优于其他任何固定剂。与单独使用Dent固定剂、4% PFA/PBS或甲醇相比，该PFA/甲醇组合所产生的信号强度也明显更强，具体效果取决于胚胎的发育时期及组织位置。

讨论

本实验室开发了PFA/甲醇法，主要目的是优化斑马鱼发育过程中磷酸化T²⁸⁷-CaMK-II表位的免疫定位。该方法成功实现了P-CaMK-II在多个纤毛器官形成过程中的定位，包括斑马鱼的Kupffer's vesicle（KV）¹²、内耳¹⁴和肾脏¹³。尤其是在KV阶段，该技术的应用十分必要。该方法的成功可能归因于以下几个因素的综合作用：a）自发荧光的最小化，b）磷酸化CaMK-II表位的保存，以及c）抗体对表位可及性的增强。

该方法的一个主要局限在于甲醇中的储存时间。虽然P-CaMK-II在-20°C的甲醇中保存两天后免疫反应性达到最高，但在甲醇中储存一周后，该表位的反应性即会丧失。目前尚不清楚此时是磷酸基团发生了水解，还是进一步的变性导致免疫反应性下降。甲醇/EGTA在-20°C下传统上被用作快速固定剂，以在早期胚胎发育过程中保存富含微管蛋白的结构。²² 然而，单独使用甲醇并不适合保存形态结构，甚至也不适合保存肌动蛋白细胞骨架等结构，因此必须先使用PFA进行固定。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-苯基-2-硫脲（PTU）	Sigma	P-7629	0.12% 储存液。在系统水中按1:40稀释
Alexa488 抗小鼠 IgG	Life Technologies	A11001	山羊多克隆抗体，使用比例为1:500
Alexa488 抗兔 IgG	Life Technologies	A11008	山羊多克隆抗体，使用比例为1:500
Alexa488 鬼笔环肽	Life Technologies	A12379	优先结合F-肌动蛋白
Alexa568 抗小鼠 IgG	Life Technologies	A11004	山羊多克隆抗体，使用比例为1:500
Alexa568 抗兔 IgG	Life Technologies	A11011	山羊多克隆抗体，使用比例为1:500
抗乙酰化α-微管蛋白	Sigma	T7451	小鼠单克隆抗体，使用比例为1:500
抗磷酸化-T287 CaMK-II	EMD Millipore	06-881	兔多克隆抗体，使用比例为1:20
总CaMK-II抗体	BD Biosciences	611292	小鼠单克隆抗体，使用比例为1:20
乙醇	Fisher	S96857	实验级，95%变性乙醇
镊子	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
玻璃盖玻片	VWR	16004-330	#1 厚度
玻璃显微镜载玻片	Fisher	12-550-15	标准玻璃载玻片
甲醇	Fisher	A411	储存于冷冻柜中
微量离心管	VWR	20170-038	带盖管，非无菌
正常山羊血清	Life Technologies	16210-064	分装为1 ml管，储存于冷冻柜中
多聚甲醛	Sigma	P-6148	试剂级，结晶状
磷酸盐缓冲液（PBS）	Quality Biological	119-069-131	10x储存液或实验室配制
吐温X-100	Sigma	BP-151	水中配制成10%溶液，室温储存
吐温-20	Life Technologies	85113	水中配制成10%溶液，室温储存
复式显微镜	Nikon	E-600	安装在无振动台面上
C1 Plus双激光扫描共聚焦显微镜	Nikon	C1 Plus	由EZ-C1程序运行，但升级版本使用"Elements"