Questo protocollo descrive le tecniche specifiche utilizzate per la caratterizzazione strutturale delle sequenze di glicosili dell'estremità riducente (RE) e della regione interna degli eterossilani etichettando il RE con 2 amminobenzammide prima dell'idrolisi enzimatica (endossilanasi) e quindi dell'analisi degli oligosaccaridi risultanti utilizzando la spettrometria di massa (MS) e la risonanza magnetica nucleare (NMR).
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive le specifiche tecniche utilizzate per la caratterizzazione di riduzione finale (RE) e la regione interna sequenza glicosil (s) di heteroxylans. De-inamidate pareti cellulari grano endosperma sono stati isolati come un residuo di alcool-solubile (AIR) 1 e in sequenza estratta con acqua (W-sol Fr) e 1 M KOH contenente 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) come descritto da Ratnayake et al. (2014) 2. Due approcci diversi (vedi sintesi in figura 1) vengono adottati. Nel primo, intatti AX W-sol sono trattati con 2AB codificare il RE backbone residuo originale zucchero catena e poi trattati con un dell'endoxilanasi per generare una miscela di RE 2AB marcato e regione interna riducendo oligosaccaridi, rispettivamente. In un secondo approccio, il KOH-sol Fr viene idrolizzato con dell'endoxilanasi per generare prima una miscela di oligosaccaridi che vengono successivamente etichettati con 2AB. I enzimaticamente rilasciati ((ONU) con tag) oligosaccaridi da entrambiW- e Frs KOH-sol sono poi metilato e l'analisi strutturale dettagliata di entrambi gli oligosaccaridi nativi e denaturato viene eseguita utilizzando una combinazione di MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS e ESI-MS n. Dell'endoxilanasi digerito Koh-sol AX si caratterizzano anche per la risonanza magnetica nucleare (NMR) che fornisce anche informazioni sulla configurazione anomerico. Queste tecniche possono essere applicate ad altre classi di polisaccaridi utilizzando le appropriate endo-idrolasi.
Introduzione
Heteroxylans sono una famiglia di polisaccaridi che sono i polisaccaridi predominanti non cellulosici delle pareti primarie di erbe e pareti secondaria di tutti angiosperme 3-6. Le dorsali Xylan si differenziano per i loro tipi e modelli di sostituzione con glicosil (acido glucuronico (GlcA), arabinosio (Araf)) e residui seconda tipo di tessuto, stadio di sviluppo e le specie 7 non glicosil (O-acetil, acido ferulico).
Le pareti di grano (Triticum aestivum L.) endosperma sono composti principalmente da arabinoxilani (AXS) (70%) e (1 → 3) (1 → 4) -β glucani-D-(20%) con piccole quantità di cellulosa e heteroman....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. L'etichettatura della Fine Riduzione (RE) Zucchero Residuo di W-sol AX con 2-aminobenzamide (2AB)
- Incubare W-sol AX con 2AB (0,2 M) in presenza di 1 M NaBH 3 CN (sodiocianoboroidruro) (pH 5,5) per 2 ore a 65 ° C per convertire le estremità riducenti delle catene polisaccaride backbone ai loro derivati fluorescenti.
ATTENZIONE: La seguente operazione deve essere eseguita nella cappa come NaBH 3 CN rilascia gas cianuro tossico quando è in contatto con l'acqua.- Pesare NaBH 3 CN (62,8 mg) e sciogliere in acqua (1 ml) in una provetta da microcentrifuga (1,5 ml) per preparare una soluzione 1 M NaBH
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La digestione dell'endoxilanasi di 2AB-etichettato W-sol AX genera una miscela di oligosaccaridi RE 2AB marcato e una serie di oligosaccaridi non-marcato (senza etichetta 2AB) derivate dalle regioni interne della catena xilano (Figura 1; da Ratnayake et al. 2). Una serie di approcci cromatografici viene quindi impiegato per frazionare il complesso miscela di isomeri. Infine, tecniche di MS sono utilizzate per identificare le strutture isomeriche c.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La maggior parte dei polisaccaridi della parete cellulare Phase Matrix hanno dorsali apparentemente sostituito in modo casuale (sia con glycosyl e residui non glicosil) che sono molto variabili a seconda delle specie di piante, stadio di sviluppo e tipo di tessuto 3. Poiché polisaccaridi sono prodotti genici secondari loro sequenza non è modello derivato e pertanto non vi è un unico approccio analitico, come esiste per acidi nucleici e proteine, per la loro sequenza. La disponibilità di purificati enzimi idro.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato supportato dai fondi del Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, forniti al cluster High Fibre Grains tramite la Food Futures Flagship. AB riconosce anche il sostegno di una sovvenzione dell'Australia Research Council (ARC) all'ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2 amminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| boroidruro di sodio (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Pericoloso, maneggiare con cura |
| cianoboroidruro di sodio (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Pericoloso, maneggiare con cura |
| endo-1,4-β-xilanasi M1 (da Trichoderma viride) (120101a) | Megazima (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Ossido di deuterio (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Liofilizzatore (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus colonna | Agilent | (2,1 volte; 100 millimetri; 1.8 µ m dimensione delle perline) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Modello - MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germania) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Modello # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - trappola ionica (Modello # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germania | ||
| Topspin (versione 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Modello # 7890B) | Agilent |
Riferimenti
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxyla....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
