Transcriptoma Profiling de<em> In-Vivo</em> embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
Perda embrionária precoce em vacas leiteiras de alta produção é um dos principais desafios para a indústria de laticínios 1, 2. Bovine tornou-se um modelo interessante para estudar o desenvolvimento pré-implantação do embrião humano devido ao seu processo de desenvolvimento semelhante 3, 4. No entanto, é necessária mais investigação para ter uma melhor compreensão sobre genes envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial de bovinos.
Depois de vinte anos desde a primeira tecnologia de microarray desenvolvido em 1995 5, o desenvolvimento da tecnologia de fabricação sonda erros de impressão reduzidos mais sofisticados e variabilidade de chips de matriz dentro e entre diferentes plataformas de microarray 6. Tecnologia de microarray melhorou amplamente resultou numa aplicação desta tecnologia em investigação clínica 7 e, mais recentemente, no embrião inicial Qavaliação ualidade 8.
A grande quantidade de material necessário para a tecnologia de microarray é a principal razão pela qual a tecnologia de microarrays inicialmente não conseguiu introduzir um número de campos de pesquisa, como o desenvolvimento embrionário inicial. Mais recentemente, métodos de amplificação de ARN foram melhorados para amplificar ARN linearmente até ao nível de sub-microgramas nanograma material de partida ARN 9. Existem vários kits de amplificação de ARN comerciais disponíveis no mercado; no entanto, os mais populares kits bem desenvolvidos estão relacionados com Ribo-Single Primer isotérmico amplificação 10 e promotor T7 conduzida 11 métodos. O mais popular de amplificação anti-sentido de ARN utiliza na transcrição in vitro com um iniciador oligo dT de ligação a um promotor de T7 na extremidade 5 '12. Esta tecnologia permite a manutenção da maior parte dos transcritos anti-sentido representativas após amplificação linear fou matrizes de hibridação 13. Este método foi adaptado para amplificar nível picograma de RNA total extraído de embriões de bovino 8.
Universal Linkage System (ULS) é o método de marcação que incorpora diretamente o DNA ou RNA amplificado com corante fluorescente ligada à platina quer Cyanine 547 ou Cyanine 647, formando uma ligação de coordenação sobre a posição N7 de guanina 14. Este método foi adaptado em investigação embriões para gerar mais estável, sem modificação ARNA amplificado em comparação com o aminoallyl ARNA modificada gerado pelo método enzimático 15. tanto métodos de corante único e rotulagem dois corantes foram adaptados usando Universal sistema de ligação em microarray. Um grande estudo comparações microarray foi que há uma boa correlação da qualidade dos dados entre as plataformas de matriz de um e dois de cor 6.
Recentemente, tanto unidade promotor T7métodos de amplificação N ARN anti-sentido e de rotulagem ULS têm sido desenvolvidos para proporcionar um protocolo mais fiável para gerar uma quantidade suficiente de materiais de alta qualidade marcado arna para hibridação microarray 8, 16. Portanto, este estudo fornece um protocolo para demonstrar algumas das etapas importantes de extração de RNA para análise de dados envolvidos em microarray de duas cores utilizando Dia 7 embriões bovinos como um exemplo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O primeiro problema a realizar análise de microarray utilizando Dia 7 embriões não é obter quantidades suficientes de ARN de alta qualidade para estudar a expressão do gene. extração de RNA fenol tradicional / clorofórmio e método de precipitação de etanol não é recomendado para o dia 7 embriões, resultando em baixo rendimento e possíveis fenol restante inibir reação de amplificação de ARN. Em vez disso, um método baseado em coluna padrão é melhor para isolar o ARN total e, em seguida, eluir o ARN …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
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