We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.
जब जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए एंजाइमों, एक प्रक्रिया है कि निर्माण, क्लोनिंग और उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की अभिव्यक्ति, विवो में उच्च आवृत्ति मुताबिक़ डीएनए पुनर्संयोजन के लिए युग्मित शामिल डिजाइनिंग Saccharomyces cerevisiae में निर्देशित विकास में कई आकर्षक लाभ प्रदान करता है। यहाँ, हम एक कवक aryl शराब oxidase (आओ) का उदाहरण अपने कुल गतिविधि में वृद्धि के आधार पर खमीर में और स्क्रीन उत्परिवर्ती पुस्तकालयों बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। दो प्रोटीन खंडों यादृच्छिक mutagenesis के द्वारा और इन विवो डीएनए पुनर्संयोजन में ध्यान केंद्रित निर्देशित विकास के अधीन थे। ~ 50 बीपी प्रत्येक खंड flanking overhangs एक linearized वेक्टर एक पूर्ण स्वायत्त नकल प्लाज्मिड को जन्म देने में आओ-संलयन जीन का सही दुबारा अनुमति दी। उत्परिवर्ती कार्यात्मक आओ वेरिएंट के साथ समृद्ध पुस्तकालयों एस में जांच की गई एक संवेदनशील उच्च throughput फेंटन प्रतिक्रिया के आधार पर परख के साथ cerevisiae supernatants। की सामान्य प्रक्रियाएस में पुस्तकालय निर्माण cerevisiae यहाँ वर्णित आसानी से कई अन्य यूकेरियोटिक जीन विकसित करने के लिए लागू किया जा सकता है, अतिरिक्त पीसीआर प्रतिक्रियाओं, इन विट्रो डीएनए पुनर्संयोजन और बंधाव कदम से परहेज।
निर्देशन आणविक विकास एक मजबूत, तेज और विश्वसनीय एंजाइमों डिजाइन करने के लिए 1, 2 विधि है। यादृच्छिक उत्परिवर्तन, पुनर्संयोजन और स्क्रीनिंग, एंजाइमों के उन्नत संस्करण उत्पन्न किया जा सकता चलने का दौर है कि नई substrates पर कार्रवाई, उपन्यास प्रतिक्रियाओं में, गैर प्राकृतिक में के माध्यम से वातावरण, या यहां तक कि नए चयापचय लक्ष्यों को हासिल करने के लिए 3-5 सेल की सहायता के लिए। निर्देशित विकास में इस्तेमाल किया मेजबानों के बीच, शराब बनानेवाला है खमीर जटिल यूकेरियोटिक प्रोटीन है कि अन्यथा प्रोकार्योटिक समकक्षों 6.7 में उपलब्ध नहीं हैं के कार्यात्मक अभिव्यक्ति के लिए समाधान की एक सूची प्रदान करता है।
कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन में विस्तृत रूप से प्रयुक्त, इस छोटे से यूकेरियोटिक मॉडल बाद translational संशोधनों, हेरफेर और परिवर्तन दक्षता में आसानी, जो सभी के लिए निर्देशित विकास 8 से एंजाइमों इंजीनियर करने के लिए महत्वपूर्ण लक्षण हैं के संदर्भ में कई फायदे हैं। इसके अलावा, उच्च आवृत्तिएस में मुताबिक़ डीएनए पुनर्संयोजन के cerevisiae अपने कुशल प्रूफ रीडिंग तंत्र के लिए युग्मित विवो में पुस्तकालय के निर्माण और जीन विधानसभा के लिए संभावनाओं की एक विस्तृत सरणी खोलता है, जटिल कृत्रिम रास्ते 9-12 करने के लिए एकल एंजाइमों से विभिन्न प्रणालियों के विकास को बढ़ावा देने। हमारी प्रयोगशाला में पिछले एक दशक में खर्च किया गया है खमीर अलग ligninases की आणविक इवोल्यूशन (प्राकृतिक लकड़ी क्षय दौरान लिग्निन की गिरावट में शामिल oxidoreductases) 13-14 के लिए उपकरण और रणनीतियों डिजाइन। इस संचार में, हम तैयार है और एस में स्क्रीन उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश एक मॉडल flavooxidase, -aryl शराब oxidase के लिए cerevisiae (आओ 15) – यह है कि आसानी से कई अन्य एंजाइमों में अनुवाद किया जा सकता है। (: मुताबिक़ इन विवो समूह द्वारा mutagenic संगठित प्रक्रिया पुनर्संयोजन morphing) खमीर सेल तंत्र 16, एक द्वारा सहायता प्रोटोकॉल एक केंद्रित निर्देशित विकास विधि शामिलदा बहुत ही संवेदनशील स्क्रीनिंग परख आदेश आओ गतिविधि संस्कृति शोरबा 17 में स्रावित पता लगाने के लिए फेंटन प्रतिक्रिया पर आधारित है।
इस अनुच्छेद में, हम टिप्स और ट्रिक्स के सबसे हमारी प्रयोगशाला एस में निर्देशित विकास द्वारा एंजाइमों के लिए इंजीनियर में कार्यरत संक्षेप है cerevisiae (आओ एक उदाहरण के रूप में उपयोग करते हुए) इतना है क?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].
1. Culture media | |||
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39 |
Bacto Agar | Difco | 214010 | |
Cloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13 |
D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16 |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16 |
D-(+)-Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | 83400 | CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51 |
Peptone | Difco | 211677 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09 |
Uracil | Sigma Aldrich | U1128 | |
Yeast Extract | Difco | 212750 | |
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids | Difco | 291940 | |
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. PCR Reactions | |||
dNTP Mix | Agilent genomics | 200415-51 | 25 mM each |
iProof High-Fidelity DNA polymerase | Bio-rad | 172-5301 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M8054 | CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91 |
Taq DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | D4545 | For error prone PCR |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Plasmid linearization | |||
BamHI restriction enzyme | New England Biolabs | R0136S | |
Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9001S | |
XhoI restriction enzyme | New England Biolabs | R0146S | |
Gel Red | Biotium | 41003 | For staining DNA |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4. FOX assays | |||
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | F3754 | CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14 |
Anysil Alcohol | Sigma Aldrich | W209902 | CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16 |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17 |
Hydrogen peroxide 30% | Merck Millipore | 1072090250 | FOX standard curve |
Xylenol Orange disodium salt | Sigma-Aldrich | 52097 | CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62 |
Agarose gel stuff | – | – | – |
Agarose | Norgen | 28035 | CAS Nº 9012-36-6 |
Gel Red | Biotium | 41003 | DNA analysis dye |
GeneRuler 1Kb Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | DNA M.W. standard |
Loading Dye 6x | Thermo Scientific | R0611 | |
Low-melting temperature agarose | Bio-rad | 161-3112 | CAS Nº 39346-81-1 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
5. Kits and cells | |||
S. cerevisiae strain BJ5465 | LGC Promochem, Spain | ATTC 208289 | Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL |
E. coli XL2-Blue competent cells | Agilent genomics | 200150 | For plasmid purification and amplification |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740,609,250 | DNA gel extraction |
NucleoSpin Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740,588,250 | Column miniprep Kit |
Yeast Transformation Kit | Sigma-Aldrich | YEAST1-1KT | Included DNA carrier (Salmon testes) |
Zymoprep yeast plasmid miniprep I | Zymo research | D2001 | Plasmid extraction from yeast |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6. Plates | |||
96-well plates | Greioner Bio-One | 655101 | Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements) |
96-well plates | Greioner Bio-One | 655161 | Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations) |
96-well plate lid | Greioner Bio-One | 656171 | Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations) |