En förenklad metod för Ultra-Low Density, Long-Term primär hippocampus Neuron kultur
Summary
Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.
Abstract
Odling primära hippocampus neuroner in vitro underlättar mekanistiska förhör av många aspekter av nervsystemets utveckling. Dissocierade embryonala hippocampus nervceller kan ofta växa framgångsrikt på glastäck vid hög densitet under serumfria betingelser, men låg kulturer densitet kräver normalt en leverans av trofiska faktorer genom samtidig odling av dem med en glia matarskikt, beredning kan vara tidskrävande och mödosam. Dessutom kan närvaron av Glia påverka bedömning av resultat och utgör hinder för studier om neuronspecifika mekanismer. Här är en förenklad metod presenteras för ultralåg densitet (~ 2000 nervceller / cm2), långsiktigt (> 3 månader) primär hippocampus neuron kultur som är under serumfria förhållanden och utan glia cell stöd. Låg densitet neuroner odlas på poly-D-lysin belagda täckglas, och vänt på höga densitet neuroner odlade i en 24-brunnsplatta. Istället för att använda paraffin punkter för att skapa ett utrymme between de två neuronala skikten, kan praktiker helt enkelt etsa plast botten av brunnen, där de höga densitet nervceller bor, för att skapa en microspace främjar låg densitet neuron tillväxt. Co-kultur kan lätt upprätthållas under> 3 månader utan betydande förlust av låga neuroner densitet, vilket underlättar den morfologiska och fysiologiska studier av dessa nervceller. För att illustrera detta framgångsrika odlingsbetingelser, är uppgifter som lämnats för att visa riklig synaps bildning i låg densitet celler efter långvarig kultur. Detta samodlingssystem underlättar också överlevnaden av glesa enskilda neuroner odlade i öar av poly-D-lysin substrat och därmed bildandet av autaptic anslutningar.
Introduction
Växande hippocampus nervceller under in vitro-betingelser möjliggör observation och experimentell manipulation av dessa nervceller som annars inte är möjligt in vivo. Denna experimentella metod används ofta för att avslöja neuronala mekanismer för tillväxt, polaritet, neurite specifikation, trafficking och subcellulär lokalisering av proteiner, synaps bildning och funktionell mognad en. Dessa in vitro odlade hippocampus nervceller, när skördas från sena embryonala stadier, är relativt ren (> 90%) glutamaterga celler av pyramidal morfologi 2. Eftersom neuroner odlades i en 2-D yta under in vitro-betingelser, medger denna metod underlättar observation, såsom levande avbildning eller immuncytokemi (ICC) färgning genom ett enda fokalplan 3; eller manipulationer, såsom läkemedelsbehandling och transfektioner 3-6. När odlas vid hög densitet, nervceller tenderar att ha höga överlevnad på grund av högre concentrations av utsöndrade tillväxtfaktorer förutom matsmältnings stöd från tillväxtmediet, och även på grund av neurit-kontaktberoende mekanismer 7. Emellertid låg densitet hippocampala neuroner är önskvärda för morfologiska studier, där en enskild neuron kan avbildas i sin helhet eller som färgats för ICC-analys. Låg densitet nervceller är svåra att upprätthålla i kultur på grund av bristande parakrina stöd och kräver därför ofta trofiska stöd från en gliaceller (typiskt kortikal astrocyter) matarskikt, som måste framställas före neuron kultur 2. När samodlas med en gliaceller feeder lager, är låg nervceller densitet odlas på täck, och sedan vänt ovanpå Glia skiktet så att de låga nervceller densitet och glia är vända mot varandra. Ett litet trångt utrymme mellan glia och neuroner skapas genom att placera paraffin vax prickar på hörnen av täck, därför att skapa en "sandwich" layout 2,8,9. De låga nervceller densitet kommer att växa wnom det begränsade utrymmet mellan Glia och täckglaset, vilket skapar en tillåtmikromiljö med koncentrerade faktorer utsöndrade av neuroner och glia. Detta tillvägagångssätt ger låg densitet, fullt utvecklade nervceller som är placerade någorlunda isär, därför underlättar ICC märkning eller levande imaging studier.
En uppenbar nackdel med neuron-glia samodling, bortsett från att vara tidsödande och arbetskrävande, är att det förhindrar studium av neuronspecifika, eller cellautonoma, mekanismer. Även om detta system är mycket mindre komplex än in vivo nervvävnad, glia inverkan på neuron utveckling genom utsöndrade, ännu-inte-helt-definierade faktorer kan förväxla experimenten 10. Därför i experiment som kräver utredning av neuron specifika mekanismer, definierade odlingsbetingelser som tar bort serum och glia stödskiktet är nödvändiga. En tidigare studie har lyckats odla låga koncentrationer av neuroner (~ 9000 celler / cm 2) med användning av en three dimensionell hydrogelmatris 11. Eftersom en relativt ren neuronal population kan odlas vid hög densitet under serumfria betingelser utan glial stöd, vi hypotesen att ultra-låg densitet av hippocampusneuroner kan odlas i serumfritt definierat odlingsmedium genom samodling dem med hög densitet neuroner, i ett sätt som är analogt med den konventionellt antagit neuron-glia samodling. I själva verket, med hög densitet hippocampus neuron kulturer i en "sandwich" konfiguration har nyligen använts för att stödja ett litet antal specialiserade magnocellulära endokrina neuroner 12.
Därför kan co-kultur med hög densitet nervceller tillåta låg nervceller densitet att få trofiska faktorer stöd som är tillräcklig för att möjliggöra långsiktig överlevnad. Detta protokoll att odla extremt låg densitet neuroner således formuleras och valideras. Protokollet kan genomföras inom ett enda experiment, genom att förbereda hög densitet (~ 250.000 celler / ml) distressebolag hippocampus neuroner först, och sedan göra en utspädning för att ge en densitet ~ 10000 neuroner / ml (~ 3000 nervceller / täck, eller ~ 2.000 neuroner / cm2), vilket är mycket lägre än de flesta rapporterade låg densitet kulturer 2,3,9 , 11,13. Denna kultur tillstånd löst kallad ultra-låg densitet "kultur och används med" låg densitet "inter-changeably. De höga densitets neuroner stryks ut på poly-D-lysin belagda 24-brunnars plattor; medan de låga neuroner densitets ympas på poly-D-lysin belagda 12-mm täckglas av glas som är placerade inuti en annan 24-brunnars platta. Täck med vidhäftande låg nervceller densitet är vänt ovanpå hög densitet nervceller två timmar senare efter nervceller härstammar och fästa vid täck. Dessutom istället för att använda paraffinvax prickar för att höja täckglasen ovanför hög densitet neuronskikt ades ett 18 G sprutnål för att etsa ned i plattor med 24 brunnar med två parallella ränder. Den resulterande deplAced, angränsande plast ger en förhöjd stöd för glastäck. Detta utrymme är konsekvent mäts vid 150-200 ^ m, vilket tillåter tillräckligt med syre och odlingsmediet utbyte samtidigt som den ger en mikromiljö med koncentrerade trofiska faktorer. Under detta tillstånd, de låga nervceller densitet växa i stor utsträckning, och kan överleva mer än tre månader i odling. När dessa neuroner transfekteras med GFP-plasmid efter tre veckor i odling, är dendriterna ymnigt översållad med Dendritutskotten. Som ett bevis på princip uppgifter presenteras för att visa att detta samarbete kultur Systemet stöder ultralåg densitet kulturer av hippocampus nervceller seedade på poly-D-lysin "mikro öar", där nervceller bildar autaptic anslutningar som kan underlätta utredning av cell -autonomous, nätverksoberoende mekanismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterar ett detaljerat protokoll för långtidsodling av ultra-låg densitet hippocampus glutamaterga neuroner under serumfria förhållanden. Vid 2000 neuroner / cm2, är densiteten ~ åtminstone två gånger lägre än de flesta "låg densitet" kultur preparat med eller utan glia stöd rapporterats av befintlig litteratur 2,3,11,13,14. Förutom att vara ultra-låg densitet, är detta protokoll ny och betydande i ytterligare två sätt. För det första behövs ingen glia matarski…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).
Materials
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. . Cultureing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
