超低密度のために簡略化された方法、長期初代海馬ニューロンの文化
Summary
Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.
Abstract
in vitroで初代海馬神経細胞を培養し、神経発達の多くの側面の機構的な尋問を容易にします。解離胚の海馬ニューロンは、多くの場合、無血清条件下で高密度にカバーガラス上で正常に成長することができますが、低密度培養は、通常、グリアフィーダー層でそれらを共培養することにより、栄養因子の供給を必要とする、の準備には時間がかかることがあります骨の折れます。また、グリアの存在は、ニューロン特異的メカニズムに関する結果と排除して研究の解釈を混乱させることができます。ここでは、簡略化された方法は、無血清条件下およびグリア細胞のサポートなしで、超低密度（〜2000ニューロン/ cm 2）で、長期（> 3ヶ月）初代海馬神経細胞培養のために提示されています。低密度ニューロンをポリ-D-リシン被覆カバーガラス上で増殖させ、24ウェルプレート中で増殖させた高密度ニューロンに反転されます。代わりにbetweeスペースを作成するために、パラフィンドットを使用してのnは2ニューロン層、実験者は、単に低密度ニューロンの成長を助長する微小空間を作成するには、高密度のニューロンが存在する上、ウェルのプラスチック製の底をエッチングすることができます。共培養は、容易に、従って、これらのニューロンの形態学的および生理学的な研究を促進する、低密度ニューロンの有意な損失なし> 3ヶ月間維持することができます。この成功した培養条件を説明するために、データは、長期培養後の低密度細胞における多量のシナプス形成を示すために提供されます。この共培養系はまた、ポリ-D-リジン基質したがってautaptic接続の形成の島で増殖させたスパース個々のニューロンの生存を促進します。
Introduction
インビトロ条件下での海馬神経細胞を成長させることは、観察し、 生体内で他の方法では不可能な、これらのニューロンの実験的操作を可能にします。この実験的なアプローチは、広く成長、極性、神経突起の仕様、輸送およびタンパク質の細胞内局在、シナプス形成および機能的成熟1の神経メカニズムを明らかにするために使用されます。後期胚期から採取するとき、これらのインビトロ培養海馬ニューロンは、錐体の形態2の比較的純粋な（> 90％）グルタミン酸細胞です。ニューロンがインビトロ条件下で2-D表面で増殖させたため、この方法は、単一の焦点面3を介して染色ライブイメージングまたは免疫細胞化学（ICC）のように、容易に観察できます。または、そのような薬物治療やトランスフェクション3-6のような操作、。高い密度で増殖させた場合、ニューロンがあるため、より高い共同の生存率が高い傾向にあります増殖培地から栄養支持に加えて、またために、神経突起接触依存性機構7の分泌された成長因子のncentrations。しかし、低密度海馬ニューロンは、個々のニューロンは、その全体が撮像されたまたはICC分析のために染色することができる形態学的研究のために望ましいです。低密度ニューロンが原因パラクリンサポートの欠如に培養中で維持するのは難しいですので、多くの場合、前の神経細胞培養の2に用意する必要があるグリア（典型的には皮質アストロサイト）フィーダー層からの栄養サポートを必要とします。時共培養グリア細胞フィーダー層を有する、低密度ニューロンをカバーガラス上で増殖させ、かつ低密度ニューロンおよびグリアが互いに対向するように、その後グリア層の上に反転されます。グリア細胞と神経細胞の間に小さな限られた空間は、「サンドイッチ」レイアウト2,8,9を作成するため、カバースリップの隅にパラフィンワックスのドットを配置することによって作成されます。低密度ニューロンはワット成長しますニューロンとグリアによって分泌された濃厚な要因と寛容な微小環境を作成し、グリア細胞とカバーガラスの間の限られた空間を、ithin。このアプローチは、したがって、ICC標識やライブイメージング研究を促進する、合理的に離れている低密度、完全に発達神経細胞が得られます。
ニューロン – グリア共培養の見かけ上の欠点は、脇に時間がかかり、面倒であることから、それはニューロン特異的、または細胞自律的、機構の研究を防ぐことです。このシステムははるかに複雑なin vivoでの神経組織よりもですが、分泌され、未完全に定義された要素を介してニューロンの発生にグリアの影響は実験10を混乱することができます。したがって、ニューロン特異的なメカニズムの研究、血清およびグリア支持層が必要で除去定義培養条件を必要とする実験です。以前の研究では、目を使用して（〜9000細胞/ cm 2）のニューロンの低濃度を培養することに成功しましたREE次元ヒドロゲルマトリクス11。比較的純粋な神経細胞集団は、グリアサポートなしで無血清条件下で高密度に培養することができるので、我々は、海馬神経細胞の超低密度で、高密度ニューロンでそれらを共培養することによって、無血清規定された培養培地中で増殖させることができるという仮説を立て従来採用ニューロン – グリア共培養に類似した方法。実際、「サンドイッチ」構成で高密度海馬ニューロン培養物は、最近、特殊な大細胞内分泌ニューロン12の小さな数をサポートするために使用されています。
したがって、高密度の神経細胞との共培養は、低密度ニューロンが長期生存を可能にするのに十分である栄養因子のサポートを受けることを可能にします。超低密度ニューロンを培養するこのプロトコルは、このように配合し、検証しました。プロトコルは、高密度を調製することにより、単一の実験内で実施することができる（〜250,000細胞/ ml）をDISsociated海馬ニューロンは、最初に、その後密度〜万ニューロンを得るために希釈を行う/ mLの（〜3,000の神経細胞/カバースリップ、または〜2,000の神経細胞/ cm 2）で大部分が低密度培養物を報告したよりもはるかに低い、2,3,9 、11,13。この培養条件は緩く「超低密度」培養と呼ばれ、「低密度」相互交換可能で使用されています。高密度ニューロンをポリ-D-リジンコートした24ウェルプレート上にプレーティングされます。低密度ニューロンをポリ-D-リシン被覆した12mmのガラスカバースリップ上に播種され、一方、別の24ウェルプレートの内側に配置されます。ニューロンが下降し、カバーグラスに添付された後に低密度ニューロンを付着させるとカバーガラスを2時間後に高密度ニューロンの上に反転しています。また、代わりに高密度ニューロン層、上記カバーガラスを上昇させるためにパラフィンワックスのドットを使用する、18 Gの注射針は、二つの平行なストライプで24ウェルプレートの底部をエッチングするために使用しました。その結果displプラスチックはガラスカバースリップのための高められたサポートを提供する隣接、出し抜か。このスペースは、一貫して濃縮された栄養因子との微小環境を提供しながら、十分な酸素と培地交換を可能にする150〜200ミクロンで測定されます。この状態で、低密度ニューロンが広範囲に成長し、培養3ヶ月を超えて生き残ることができます。これらのニューロンは、培養3週間後にGFPプラスミドでトランスフェクトされる場合には、樹状突起は、やたらと樹状突起棘がちりばめられています。原理の証明として、データは、この共培養系は、神経細胞が細胞の調査を容易にすることができるautaptic接続を形成し、ポリ-D-リジン「マイクロアイランド '上に播種した海馬神経細胞の超低密度培養物をサポートすることを示すために提示されています-autonomous、ネットワークに依存しないメカニズム。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、無血清条件下での超低密度海馬グルタミン酸作動性ニューロンの長期培養のための詳細なプロトコルを提示します。 / cm 2の〜2000ニューロンでは、密度は、少なくとも2つの既存の文献2,3,11,13,14によって報告されたグリアサポートの有無にかかわらず、ほとんどの「低密度「文化の準備よりも倍低いです。超低密度であることに加えて、このプロトコルは、新規で2?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).
Materials
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. . Cultureing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
