Ce travail décrit un protocole de différenciation in vitro pour produire pigmentées, mélanocytes matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines par une crête neurale et mélanoblaste étape intermédiaire en utilisant un protocole de 25 jours sans alimentation.
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Article de méthode
Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) représentent une plate-forme pour étudier le développement humain in vitro dans des conditions normales et pathologiques. Les chercheurs peuvent orienter la différenciation des hPSC dans le type de cellule d’intérêt en manipulant les conditions de culture pour récapituler les signaux observés au cours du développement. L’un de ces types de cellules est le mélanocyte, une cellule productrice de pigments d’origine de la crête neurale (NC) responsable de la protection de la peau contre les rayons UV. Ce protocole présente une extension d’un protocole de différenciation de la crête neurale in vitro actuellement disponible à partir de hPSC pour différencier davantage les NC en mélanocytes entièrement pigmentés. Les précurseurs de mélanocytes peuvent être enrichis à partir du protocole Neural Crest via une exposition programmée à des activateurs de la signalisation WNT, BMP et EDN3 dans des conditions de double inhibition SMAD. Les précurseurs de mélanocytes résultants sont ensuite purifiés et matures en mélanocytes entièrement pigmentés par culture dans un milieu sélectif. Les mélanocytes résultants sont entièrement pigmentés et se colorent de manière appropriée pour les protéines caractéristiques des mélanocytes matures.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) fournissent une plate - forme pour imiter la différenciation normale de façon évolutive pour la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et les thérapies de remplacement cellulaire 1-6. D'un intérêt particulier, hPSCs ouvrent des pistes pour l'étude difficile d'isoler ou de types rares / transitoires cellulaires où les échantillons des patients sont rares. Les cellules souches pluripotentes En outre, induites (CSPi) permettent aux chercheurs d'étudier le développement et la modélisation de la maladie d'une manière spécifique au patient de démêler les mécanismes uniques
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Protocole
NOTE: Le protocole de mélanocytes décrit ici a été démontrée par Mica et al.
1. Vaisselle Préparation du milieu de culture, enduit et entretien de hPSCs
- moyen Préparation
Remarque: Conserver tout milieu à 4 ° C dans l'obscurité pendant 2 semaines. Filtrez tous les moyen de stérilisation.- Préparer DMEM / 10% de FBS. Mélanger 885 ml de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml Pen / Strep et 5 ml L-glutamine. Filtre pour la stérilisation.
- Préparer CSEh moyen. Mélanger 800 ml de DMEM / F12, KSR 200 ml, 5 ml de L-glutamine, de 10 ml de MEM au moins une solution d'acides aminés essentiels, 1 ml de ß-mercaptoethano....
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Résultats
Ce protocole fournit un procédé pour dériver, les mélanocytes matures totalement pigmentées à partir hPSCs d'une manière in vitro libre dispositif d' alimentation, rentable et reproductible. Par contraste avec les Fang et al. Protocole précédemment établie pour les mélanocytes HPSC dérivés, le protocole décrit ne nécessite pas de milieu conditionné et diminue l'exigence de temps. Le protocole Fang et al. , Utilise un milieu conditionné provenant d&#.......
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Discussion
Pour la différenciation réussie de mélanocytes de hPSCs les suggestions suivantes devraient être prises en considération. Tout d'abord, il est essentiel de travailler dans des conditions de culture stériles en tout temps. En outre, il est important de commencer par pluripotentes, hPSCs complètement indifférenciées; si la population de départ contient des cellules différenciées, le rendement sera invariablement tomber que les contaminants ne peuvent pas être dirigées vers mélanocytes et peuvent encore perturber les c.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont aucun intérêt à divulguer contradictoires.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une bourse pour les chercheurs de mélanome de la Fondation M. Joanna Nicolay et par les Instituts nationaux de la santé en vertu de Ruth L. Award Research Service national Kirschstein F31. Ce travail a également été soutenu par des subventions de NYSTEM et l'initiative sur les cellules souches Tri-institutionnelle (Starr Foundation).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo transfert humain | Sigma | T1147 | |
| Acide ascorbique (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (supplément B27) | Invitrogen | 17504044 | |
| &beta ;-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R& D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R& D Systems | 4423 | 6 mM |
| Toxine cholérique | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| AMPc (AMPc cyclique) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexaméthasone | Sigma | D2915-100MG | 50 &mu ; M |
| DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco’s Modified Eagle Medium : Mélange de nutriments F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 | poudre Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothéline-3, humain) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 &mu ; |
| M Fibronectine | BD Biosciences | 356008 | 200 &mu ; g/ml |
| de gélatine (PBS sans Mg/Ca) | en interne | 0,1 % dans PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline humaine | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix ; | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Faible teneur en glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel | matrix BD Biosciences | 354234 | Dissoudre 1:20 dans DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Fibroblastes embryonnaires de souris (7 millions de cellules/flacon) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Laminin-I de souris | R& D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Milieu neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| Péniciline/Streptomycine | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10 000 U/ml |
| Poly-L Bromhydrate d’omithine | Sigma | P3655 | 15 mg/ml ; |
| Progestérone | Sigma | P8783 | 0,032 g dans 100 ml 100 % éthanol |
| Chlorhydrate de putrescine | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (FGF humain recombinant basique) | R& D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1814 | 10 mM |
| Sélénite | Sigma | S5261 | |
| Bicarbonate | de sodium Sigma | S5761 | |
| SCF (Facteur de cellules souches humaines recombinantes) ; | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 &mu ; g/ml |
| TYRP1 (G-17) Anticorps | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| Anticorps TYRP2 | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsine-EDTA (0,05 %) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dichlorhydrate | Tocris-R& D Systèmes | 1254 | 10 mM |
Références
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
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