JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Coltivare cellule primarie epiteliali nasali da bambini e riprogrammare in cellule staminali pluripotenti indotte

Published: March 10, 2016
doi:
10.3791/53814
, , , ,
1Pyrosequencing Core,Cincinnati Children’s Hospital, 2Division of Developmental Biology,Cincinnati Children’s Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine,Seattle Children’s Hospital, 4Division of Asthma Research,Cincinnati Children’s Hospital

Summary

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Abstract

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

Introduction

Le cellule staminali pluripotenti indotte da campioni umani (hiPSCs) sono una tecnologia in rapido sviluppo della ricerca sulle cellule staminali. Essi offrono un'alternativa alle cellule staminali embrionali (hESC) ricerca con molti meno inconvenienti etici e morali 1,2. Anche se non sono identici a epigeneticamente hESC 3-5, hiPSCs offrono un modo unico per modello di sviluppo e di malattia fenotipi, e possono essere derivati ​​da tessuti rilevanti per lo stato di malattia 5-8. Nuovi metodi di hiPSCs elettrogeni sono costantemente in fase di studio per identificare i tipi di cellule ottimali per cominciare, come un modo per preparare iPSCs GMP qualità adatte per il trapianto, e anche per aumentare la tempestività e l'efficienza del processo di riprogrammazione 6,9-11.

Cellule epiteliali delle vie aeree sono fondamentali per lo sviluppo di infiammazione allergica 12, e l'epitelio è una delle principali cause di reazioni allergiche e rimodellamento delle vie aeree attraverso l'interazione con immunE e stromali cellule. L'epitelio delle vie aeree gioca un ruolo essenziale nella genesi e la persistenza di malattie polmonari come asma. Tuttavia, più bassa delle vie aeree cellule epiteliali sono difficili da ottenere in un ambiente clinico, soprattutto da pazienti sani di controllo e bambini. I dati provenienti da diversi studi supportano la premessa che le cellule epiteliali da mucose nasali sono un proxy valido e pratico per vie aeree inferiori cellule epiteliali 13-20, soprattutto quando si studiano le risposte alle sostanze inquinanti e allergeni. La mucosa nasale si compone di oltre il 90% di cellule epiteliali ciliate delle vie aeree e di campionamento queste cellule epiteliali nasali (NEC) può essere facilmente effettuata in bambini di età quattro o cinque, in quanto è meno invasivo rispetto ad altre tecniche di campionamento di cellule / tessuti ed è associato con un rischio minimo di effetti collaterali come l'infezione 20-23. Esso offre un modo veloce e semplice per assaggiare sia i bambini sani e malati senza lunghe, inutili, e spesso doloroso Operazi broncoscopiares che necessitano di sedazione. Studi precedenti hanno dimostrato che i sottotipi di malattia correlati alla gravità dell'asma possono distinguere sia nella mucosa nasale e campioni di cellule bronchiali prelevati da bambini asmatici, e l'espressione genica tra i due tipi di tessuto era simile in circa il 90% dei geni non onnipresenti 22 , 24. Come fonte per iPSCs, NEC offrono vantaggi rispetto ad altri tipi di cellule utilizzate di frequente. I fibroblasti sono spesso utilizzati per la generazione COPSI, ma anche se queste cellule possono essere facilmente coltivate da una biopsia cutanea, questo processo richiede tipicamente anestesia locale, una incisione e suture, ed è associata con qualche rischio di infezione. Pertanto, ottenendo consenso informato dai pazienti per questo tipo di biopsia può essere difficile 25. Una alternativa al fibroblasti è cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). Tuttavia, può essere difficile ottenere sangue sufficiente per la generazione COPSI da pazienti pediatrici. In aggiunta, ci sono limitazioni di ap vallecomplicanze di fibroblasti e cellule del sangue iPSCs derivate, in particolare la loro capacità di differenziazione di alcuni tipi di cellule 5,26. Pertanto, data la relativa accessibilità e il basso rischio di effetti collaterali a seguito della loro raccolta, NEC rappresentano una fonte di cellule ideale per la generazione iPSC da popolazioni pediatriche.

iPSCs hanno ricevuto molta attenzione recentemente come una piattaforma per lo studio dello sviluppo umano, la generazione di modelli di malattia romanzo, e come una potenziale fonte di cellule per le terapie personalizzate. Prima di tutto il potenziale di questa tecnologia può essere realizzato, le basi molecolari del processo di riprogrammazione hanno bisogno di essere chiariti, ma per ora questo protocollo e le procedure descritte nel potranno chiarire gli studi di ricerca focalizzati sulle esposizioni delle vie respiratorie, oltre a fornire una piattaforma per studiare gli effetti della medicina personalizzata che coinvolgono iPSCs.

Il lavoro di collaborazione di diversi laboratori ha portato alla generation di una tecnica efficace non solo per campionare la mucosa nasale, ma anche coltura NEC, e riprogrammare queste cellule per iPSCs 23. Questo articolo fornisce uno schema di un protocollo per il campionamento ottimale, coltura e condizioni di riprogrammazione.

Protocol

Il seguente protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana istituzioni. 1. Campionamento la mucosa nasale NOTA: ottenere campioni da soggetti che sono liberi di segni di infezione virale delle vie respiratorie. Preparare un 15 ml fresca conica prima della visita partecipante e aggiungere 2 ml BEGM (epiteliali bronchiali Media cellulare crescita) più 20 ml sterile Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%). spazzola di …

Representative Results

La parte iniziale del naso, chiamato il vestibolo nasale, è l'area circondata da cartilagine 29. La spazzola deve andare liscio passato questa zona del naso, oltre la valvola nasale (ostium internum, o "buco nero" visto sul retro della nare), e il campione è ottenuta dalla turbinato inferiore (Figura 1). I turbinati nasali sono strutture ossee che aumentano la superficie del naso 29, che li rende un luogo ideale per il campionamento….

Discussion

Cellule epiteliali nasali (NEC) sono una piattaforma accessibile per studiare le malattie delle vie respiratorie, e NEC-iPSCs offrono un viale emozionante di esplorare lo sviluppo della malattia, il trattamento e la terapia 1,31,32. NEC può essere facilmente ottenuto senza procedure nocive stressanti o potenzialmente 6,23. Nella nostra esperienza, il campionamento della mucosa nasale come descritto in questo protocollo appare meno stressante e meglio percepita di raccolta sangue per i bambini. Per…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero riconoscere il pluripotenti cellule staminali strumento e la Confocale Imaging Nucleo presso l'Ospedale dei bambini di Cincinnati. Questo lavoro è stato sostenuto da R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) e 2U19AI70235 (GKKH).

Materials

15mL conical Fisher Scientific 14-959-49D Protocol Step 1.1.
BEGM Lonza CC-3170 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide Life Technologies 15240-062 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep Life Technologies 15140-122 Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush Fisher Scientific 22-263-357 Protocol Step 1.2.
trypan blue Fisher Scientific MT-25-900-CI Protocol Step 2.1.
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-54 Protocol Step 2.1.
PBS Fisher Scientific BP2438-4 Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357 Protocol Step 2.2.
cytospin funnel Fisher Scientific 23-640-320 Protocol Step 2.2.
Cytospin 4 Fisher Scientific A78300003 Protocol Step 2.2.
blank slide Fisher Scientific S95933 Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit Fisher Scientific 22-122-911 Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1 Life Technologies A1064401 Protocol Step 3.2.
T25 flask Fisher Scientific 08-772-45 Protocol Step 3.3.
Trypsin Lonza CC-5012 Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002 Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65°C for 30min Sigma-Aldrich F2442 Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% -  Sigma-Aldrich D2650 Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus* e.g. Millipore SCR511 Protocol Step 6.4. 
A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting 
polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220 Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem  GSC-6301G Protocol Step 6.4.
hESC media See recipe included in protocol Protocol Step 6.11.
SB431542 Stemgent 04-0010 Protocol Step 6.11.
PD0325901 Stemgent 04-0006 Protocol Step 6.11.
Thiazovivin  Stemgent 04-0017 Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel BD Biosciences 354277 Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well Fisher Scientific 08-772-1B Protocol Step 6.13.
mTeSR1 StemCell 5850 Protocol Step 6.13.
250mL disposable filter flask (0.22µm) Fisher SCGP-U02-RE 
dispase StemCell 7923 Protocol Step 7.3.
DMEM/F12 Life Technologies 11320-033 Protocol Step 7.3.
cell lifter Fisher Scientific 08-100-240 Protocol Step 7.4.
hESC Media** Protocol Step 6.11.
components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4°C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37°C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media Invitrogen  11330-032 Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR) Invitrogen 10828-028 0.2
200mM L-glutamine Invitrogen 25030-081 1mM
55mM ß-mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 0.1mM
100x non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1x
2ug/mL Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) Invitrogen 13256-029 4ng/mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. . Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076 (2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. ‘Epigenetic memory’ phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).

Tags

Keywords: Nasal Epithelial CellsInduced Pluripotent Stem CellsIPSCsAerated DiseaseAsthmaEpigenetic VariationAir PollutionNasal SamplingReprogrammingBEGMCytology BrushLive/dead Cell Stain
check_url/53814?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ulm, A., Mayhew, C. N., Debley, J., Khurana Hershey, G. K., Ji, H. Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53814, doi:10.3791/53814 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image