Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.
Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.
Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.
Den mikroobjektglas diffusion assay og farvestoffet-frigivelsesassay tilvejebringer fordele for detektion og karakterisering af hidtil uidentificerede protein antimikrobielle midler. Disse hurtige og følsomme metoder tillader high-throughput screening af organismen source-biblioteker til identifikation af enzymer af interesse forud for investere større forskningsressourcer. Som høj profil målenzymer er identificeret, kan variationer af detektions- assays anvendes til hurtigt at detektere enzym eller at bestemme biokemiske karakteristika af enzymet. For eksempel under en flertrins proteinoprensning ordning fastsætter mikroobjektglas diffusion assay kan hurtigt påvise fraktioner indeholdende enzymet af interesse. Derudover kan reaktionen optima for enzymet bestemmes ved ændring af reaktionsbetingelserne buffere og inkubationstemperaturer i farvestoffet-release assay.
Rækken af enzym masse, der kræves til detektion i mikroobjektglas diffusion assay er en funktion af enzym træk ennde egenskaber. begrænsninger af assayet Detection kræver almindeligvis anvendelsen af højere mængder af enzym end farvestoffet-release assay. I denne undersøgelse sammenligning af påvisningsgrænserne for den mikroobjektglas diffusion assay (figur 1) til farvestoffet-frigivelsesassay (figur 4) viste, at mikroobjektglas diffusion assay er en mindre følsom teknik end farvestoffet-release assay. Når enzymkoncentrationen er ikke en bekymring, det mikroobjektglas analysen giver mulighed for hurtig indledende screening af biblioteker til produktion af protein antimikrobielle stoffer mod mål substrater med lave arbejdskraftomkostninger og udstyr krav. Selv om det indebærer større indsats og udstyr, farvestoffet-frigivelsesassay er mere følsom og reproducerbar, hvilket gav kvantitative resultater, der tillader sammenligning mellem farvestof-frigivelse assays af samme eller forskellige enzymer for et givet substrat. De to metoder er let udføres i de fleste mikrobiologiske laboratorier uden behov for højt specialiseret instrumentering. I reprætive assays, kontrol enzym, α-chymotrypsin, blev påvist ved mængder så lave som 100 ng (figur 5) ved anvendelse af farvestof-frigivelse-assay, mens den minimale mængde påvist i mikroobjektglas diffusion assayet var 1 pg (data ikke vist).
Forudsat nytte som en kvalitativ påvisning assay for antimikrobielle enzymer, har en række variationer af diffusion assay rapporteret 11,13. Ved at gennemgå disse analyser blev mikroobjektglas diffusion assay udviklet for sin relativt høj følsomhed som en indledende screening og for dens lette reaktion overholdelse. Modificeret fra arbejdet i Lachica et al. 11, hvori agarose overlays blev anvendt til at detektere produktionen af nukleaser af stammer af Staphylococcus aureus, den mikroobjektglas diffusion assay fungerer på samme måde som den radiale immunodiffusionsmetoden 14 som proteinet diffunderer fra brønden ind i agarose indeholdende substratet. Den radiale immunodiffusionen metode stopper udvidelsen af zonen af immunofældning når systemet når en kompleksdannelse ligevægt mellem den diffuserende antigen og antistof i agarose. I modsætning hertil er substratet af mikroobjektglas diffusion assay oprindeligt fordøjet af den spredende protein antimikrobielle i et stadigt voksende zone af lyse omkring brønden. Den stigende diameter af zonen fortsætter indtil enzymet mister aktivitet eller substratet er opbrugt. Hastigheden for produktionen af den zone af lyse er levendegjort som renheden, og dermed den specifikke aktivitet af enzymet eller koncentrationen af enzymet til brønden stiger.
For kvantitativt at vurdere den enzymatiske aktivitet af protein antimikrobielle stoffer mod varmedræbt B. subtilis, farvestoffet-release assay blev valgt. Kolorimetriske assays under anvendelse af Remazol brilliant blue R-farvestof (RBB) -mærkede substrater tillader alsidig og følsom evaluering af protein antimikrobiel aktivity. Enzymatisk hydrolyse af RBB-mærket substrat resulterer i frigivelse af opløselige blå produkter, der let kan måles med et spektrofotometer ved 595 nm. Adskillige variationer af RBB farvestof-frigivelsesassay, udviklet til at karakterisere andre protein antimikrobielle enzymer, viser fleksibiliteten i dette assay til anvendelse med andre substrater. For eksempel i bestemmelse af virkningerne af lysostaphin bakteriolytisk aktivitet, Zhou et al., Rapporterede et farvestof-frigivelse under anvendelse af RBB-farvet stafylokokceller og stafylokok peptidoglycan som substrater 12. I en modifikation af anvendelsen af denne RBB dye-frigivelsesassay blev RBB-mærket Micrococcus luteus substrat foreslået til anvendelse som et hurtige og følsomme midler til at diagnosticere og screening for sygdomme, såsom bakteriel infektion og tilstedeværelsen af en malign carcinom, som kan korreleres til humane lysozym ekspressionsniveauer i blodserum 15. Desuden RBB-mærkede bakterielle celle substrater har enLSO blevet anvendt i et zymogram metode til påvisning af lysozym 16.
Vi demonstrerer den sænkede detektionsgrænsen, bekvemmelighed og reproducerbarhed af farvestoffet-frigivelsesassay, der giver mulighed for hurtig screening bibliotek til enzymproduktion. Ændringer af analysen giver mulighed for efterfølgende kvantitative biokemiske karakterisering analyser, herunder effekter af temperatur, pH og saltindhold samt virkningerne af andre proteolytiske enzymer på aktiviteten af antimikrobielle proteiner 6. Desuden kan den kvantitative dye-frigivelsesassay anvendes til at sammenligne aktiviteterne i flere enzymer til et givet substrat. RBB dye-frigivelsesassay har rapporteret anvendelighed til enzymer med aktivitet mod polysaccharider foruden karakterisering og påvisning af protein antimikrobielle midler. Pettersson og Eriksson rapporterede et assay til påvisning endoglycanase aktivitet ved anvendelse af amorfe, RBB-farvet polysaccharid perler af cellulose, xylan, mannan, og gældsbevisi 17. I en udvidelse af disse resultater blev en følsom metode til påvisning af chitinase enzymer produceret af Bacillus thuringiensis Bt-107 udviklet ved hjælp af kolloid chitin mærket med RBB 18. Fra disse og andre studier har kommercielt tilgængelige kilder til RBB-farvet substrater opstået til anvendelse i detektion af glycolytiske aktivitet, herunder dem mod keratin, amylopectin, amylose, glycogen, laminarin, d-xylan, Azo-byg glucan og stivelse.
I denne undersøgelse udviser vi anvendeligheden af farvestoffet-frigivelsesassay i en mikroplade format, reducere mængden af RBB-mærkede substrat og enzym, der kræves for at producere den kolorimetriske resultat. Som illustreret i figur 4 og figur 5, mikropladen farvestof-frigivelse assay tilvejebringer en lavere detektionsgrænse end den mikroobjektglas diffusion assay for enzymatisk aktivitet detektion. Med hensyn til hurtig udnyttelse, bevarelse af arbejdskraft, og nem fortolkning, mikrofonenroslide diffusion assay tilvejebringer anvendelighed i indledende high-throughput screeninger for tilstedeværelsen af antimikrobiel aktivitet samt indikationen af antimikrobiel protein tilstedeværelse i downstream proteinisolerings- og oprensningstrin. Kombinationen af disse to analyser supplerer hinanden i den indledende screening og ultimativ karakterisering af nye protein antimikrobielle stoffer
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
cork borer | Humboldt | H-9661 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
phosphate-buffered saline (1×) | Teknova | P0200 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution | |||
agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
|||
250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
|||
200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |