שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים
Summary
Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.
Abstract
תאי דנדריטים (DCS) הם תאים מקצועיים מציגי אנטיגן אחראים בעיקר על רכישה, עיבוד והצגת אנטיגנים על אנטיגן הצגת מולקולות ליזום חסינות T-cell בתיווך. ניתן להפריד תאים דנדריטים לכמה תת phenotypically והטרוגנית מבחינה תפקודית. שלושה תת חשוב של תאים דנדריטים הטחול הם plasmacytoid, CD8α קופה CD8α נג תאים. הקל DCS plasmacytoid מפיק טבעי מסוג שאני אינטרפרון חשוב חסין תא T אנטי ויראלית. תת CD8α נג DC מתמחה בגין הצגת אנטיגן הכיתה MHC II ומעורב מרכזי תחול תאי CD4 T. קל DCS Pos CD8α אחראים בעיקר עבור צולבות הצגת אנטיגנים אקסוגניים תחול תא CD8 T. קל DCS Pos CD8α הוכח להיות יעיל ביותר על הצגת אנטיגנים glycolipid ידי מולקולות CD1d על cel T מיוחדהאוכלוסייה l המכונה T קטלניים טבעי משתנה (iNKT) תאים. מינהל של ליגנד FLT-3 מגביר את תדירות הגירה של אבות תאים דנדריטים ממח העצם, בסופו של דבר וכתוצאה מכך הרחבה של תאים דנדריטים באיברים הלימפה היקפי במודלים Murine. אנחנו צריכים להתאים את המודל הזה לטהר מספר גדול של תאים דנדריטיים פונקציונלי לשימוש בניסויים תא העברה להשוות in vivo מיומנות של תת DC שונים.
Introduction
תאי דנדריטים (DC) נתגלו לפני כמעט ארבעים שנה כמו "stellate הגדול (Dendron היוונית) התא" נמצא באיברי הלימפה 1. מחקרים רבים הראו כי DCs הם אנטיגן רק תאי מציגים שיכולים לעורר נאיביים בתאי T 2 ביעילות. תפקידה העיקרי של תאים אלה הוא ספיג והצגת אנטיגנים והעיבוד היעיל שלהם וטעינה של אלה על מולקולות מציגי אנטיגן. טחול עכבר, DCS ניתן לחלק plasmacytoid לבין תת-קונבנציונלי. הקל DCS plasmacytoid מאופיין ביטוי הנמוך של CD11c ורמות גבוהות של B220 ו Gr-1. הם גם חיוביים עבור mPDCA1 סמן משטח ומפרישים מסוג I אינטרפרון בתגובה האגרה כמו 9 קולטן (TLR9) הליגנדים. הקל DCS הקונבנציונלי גבוה עבור CD11c והביטוי השני בכיתת MHC. הם יכולים להיות מחולקים לשלוש קבוצות משנה נבדלים זה מזה המבוססים על ביטוי השטח של סמנים פנוטיפי כגון CD4, CD8α, DEC205, CD11b ו קולטן 2 מעכבות תאים דנדריטים (DCIR2, מוכר על ידי נוגדן 33D1) חלבונים 3,4. קל DCS Pos CD8α ידועים גם בשם cDC1, הן חיוביות עבור DEC205, אבל שלילי עבור סמנים מיאלואידית כגון CD11b ו 33D1. CD8α נג DCS, המכונה גם cDC2, הן חיוביות עבור 33D1, CD11b ו CD4, אך עדיין חסר DEC205. תת שלילי כפול (כלומר, שלילי עבור שניהם CD4 ו CD8α) היא נדירה יחסית, והוא שלילי DEC205 ו 33D1. זהו משנה לפחות מאופיין ועלול להיות צורה פחות מובחנת של CD8α נג DC.
הבדלים פנוטיפי של תת DC השונה גם להאריך לפונקציות in vivo שלהם. קל DCS נג CD8α הם phagocytic מאוד נחשבים להציג אנטיגן אקסוגניים בעיקר דרך רמה MHC II לתאי CD4 T 3. לעומת זאת, DCs Pos CD8α מתמחים בגין הצגת אנטיגן חלבון מסיס על דיוק I MHCבמנגנון הנקרא-מצגת צלב. התוצאה של הצגת צלב תלוי את מצב ההפעלה של DCs אלה 5, והוא יכול גם להוביל להרחבת תאי T ציטוטוקסיים (תאי-ההרג) או התפתחותם של תאי רגולטוריים T 6 2,7. מיקוד של אנטיגן כדי CD8α Pos DCs באמצעות תוצאות משלוח אנטי DEC205-נוגדן בתיווך בעיקר את המחיקה של תאי T 8, ואילו הצגת אנטיגנים שמקורם בתאי אפופטוטיים נגועים גורמת לתגובת CTL חזקה 9.
בנוסף להכרה אנטיגנים פפטיד, המערכת החיסונית היונקת התפתחה להכיר שומנים אנטיגנים glycolipid. אנטיגנים אלה מוצגים על ידי מולקולות CD1, אשר הם חלבונים פני התא אני- כמו בכיתה MHC הקיימים בצורות הקשורות מרובים אצל יונקים שונים. בעכברים, סוג אחד של המולקולה CD1 שמור ביותר בשם CD1d אחראי הצגת אנטיגנים glycolipid 10. העיקרי אוכלוסיית תאי T שמזהים מתחמי CD1d / glycolipid נקראת תאי NKT משתנים (תאי iNKT). תאים אלה מבטאים קולטן תא T למחצה משתנה (TCR) מורכבת שרשרת TCRα משתנה כי היא זיווג עם שרשראות TCRβ שיש להם מוגבלות המגוון 11. שלא כמו תאי T קונבנציונליים שצריכים להתרבות להבדיל להפוך לתאי T מפעיל מופעלים, תאי iNKT להתקיים בתור אוכלוסייה מפעיל ולהתחיל להגיב במהירות לאחר מתן glycolipid 12. זיהוי של תאים מציגי אנטיגן השומנים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית הוא אזור פעיל של מחקר, וכמה סוגי תאים ברורים, כגון תאי B, מקרופאגים DCs הוצעו כדי לבצע את התפקיד הזה. עם זאת, זה הודגם כי משנה Pos CD8α של DCs הוא התא הראשוני בתיווך ספיג והצגת אנטיגנים שומנים לתאי העכבר iNKT 13 ו בתיווך glycolipid-יחול צלב של תאי CD8 T 14.
ove_content "> כדי להשוות את היעילות של מצגת אנטיגן על ידי הצגת תאי אנטיגן שונים, גישה פשוטה היא להעביר סוגים שונים של נגמ"שים מטוהרים פעמו עם כמויות מקבילות של אנטיגן לתוך מארחיהם תמימים. ניסויי תא העברה מסוג זה מבוצעים לעתים קרובות ללימודים אימונולוגית. עם זאת, ביצוע מחקרי העברה עם אנטיגן vivo לשעבר DCs מטופל הוא מאתגר, שכן התאים הללו קיימים אוכלוסיות נדירות כמו באיברים הלימפה, שם הם מהווים פחות מ -2% של תאים הכוללים 15. לכן, יש לחזק את הפיתוח של תאים אלה בחי תורם כדי להגביר את היעילות של פרוטוקולי בידוד.זה ידוע כי הלימפה המשותף ואת אבות מיאלואידית משותפים, אשר נדרשים עבור דור של PDC, CD8 קופת CD8 נג DC תת, המפורש FMS הקשורות טירוזין קינאז קולטן 3 (FLT-3). עם in vivo FLT-3 ליגנד (FLT-3L) הממשל, emigratיון של FLT-3 להביע ובתאים ממח עצם הוא גדל, וכתוצאה מכך הזריעה של איברי הלימפה פריפריה גדלה והרחבת צאצאי DC הבוגרת שלהם 16. ביטוי של FLT-3 הוא אבד במהלך מחויבות B, T או NK מסלולי התמיינות תאים. לכן, שינויים מינימליים בלבד הם נצפו בתאים אלה על הממשל FLT-3L. התרחבות דומה באוכלוסיות DC הוא ציין בעכברי נושאי גידולים שנוצרו על ידי השתלת קו תא B16-מלנומה מפריש FLT-3L בעכברים, אשר מספקת שיטה פשוטה וחסכונית למתן רמות מערכתיות מתמשכות של המשפט פרם-3L 17,18. בגישה זו, פתחנו פרוטוקול מבוסס על השתלת תאי B16-מלנומה מפריש FLT-3L כדי לעורר את הרחבת כל תת DC הנורמלי טחול עכבר, ולכן מאוד הגדלת התשואות של תאים אלה שיכולים להיות מבודדים לניסויים הבאים . אנחנו מוצאים בעקביות כי תוך 10 – 14 ימים לאחר im תת עוריתמטע של הגידול והסתרתו FLT-3, עכברים לפתח splenomegaly עם העשרה ניכר של DCs להוות 40 – 60% של תאי טחול הכולל. מ spleens אלה, תת DC שונה יכול להיות מבודד עם טוהר גבוה באמצעות תקן זמינה מסחרי ערכות טיהור תא המעסיקות סמנים פנוטיפי משנה ספציפי.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי דנדריטים מתקבלים להיות אנטיגן המקצועי הגדול הצגת תאי המעורבים יחולו התגובות של תאי T. הפונקציה העיקרית שלהם היא לסקור את microenvironment הרקמות על ידי תופס ועיבוד אנטיגנים להגשה תא T. על מנת ללמוד את הפונקציה של תת-מערכות ספציפיות DC, אלה צריכים להיות מבודדים בכמות מספקת ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי AI45889 מענק NIH / NIAID כדי SAP תזרים cytometry מחקרים בוצעו באמצעות מתקני הגרעין FACS נתמך על ידי מרכז הסרטן איינשטיין (NIH / NCI CA013330) ואת המרכז לחקר האיידס (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al. ,2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media | |||
| 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer: | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000- |
2,000 Units of collagenase activity per ml This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer’s patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
