En effektiv och High Yield Metod för isolering av mus dendritiska cellundergrupper

Summary

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Abstract

Dendritiska celler (DC) är professionella antigenpresenterande celler i första hand orsakar att förvärva, bearbeta och presentera antigener på antigenpresenterande molekyler för att initiera T-cellförmedlad immunitet. Dendritiska celler kan separeras i flera fenotypiskt och funktionellt heterogena delmängder. Tre viktiga delmängder av mjälte dendritiska celler är plasmacytoid, CD8a ^Pos och CD8a ^Neg celler. De plasmacytoid DCs är naturliga producenter av typ I interferon och är viktiga för antiviral T-cellimmunitet. CD8a ^Neg DC delmängd är specialiserad för MHC klass II antigenpresentation och är centralt involverad i priming CD4 T-celler. CD8a ^Pos DC är primärt ansvariga för kors presentation av exogena antigener och CD8 T-cell priming. CD8a ^Pos DCs har visat sig vara mest effektiv vid presentationen av glykolipid antigener genom CD1d molekyler till en specialiserad T cell befolkning kallas invariant naturliga mördar T (inkt) celler. Administration av Flt-3 ligand ökar frekvensen av migration av dendritiska celler stamceller från benmärg, vilket slutligen resulterar i expansion av dendritiska celler i perifera lymfoida organ i musmodeller. Vi har anpassat denna modell för att rena stora mängder av funktionella dendritiska celler för användning i cellöverförings experiment för att jämföra in vivo kunskaper olika DC delmängder.

Introduction

Dendritiska celler (DC) upptäcktes nästan fyrtio år sedan som "stora stel (grekiska kvistar) cell" som finns i lymfoida organ ^1. Många studier har visat att DC: er är de enda antigenpresenterande celler som effektivt kan stimulera naiva T-celler ^2. En viktig funktion av dessa celler är upptaget och presentation av antigener och effektiv behandling och lastning av dessa på antigenpresenterande molekyler. I musmjälte kan DCs delas in plasmacytoid och konventionella delmängder. De plasmacytoid DC kännetecknas av lågt uttryck av CD11c och höga nivåer av B220 och Gr-1. De är också positivt för ytmarkör mPDCA1 och utsöndrar typ I interferon som svar på toll like receptor 9 (TLR9) ligander. De konventionella DC är höga för CD11c och MHC klass II uttryck. De kan delas upp i tre distinkta undergrupper baserade på ytexpression av fenotypiska markörer såsom CD4, CD8a, DEC205, CD11b och dendritiska celler hämmande receptor 2 (DCIR2, erkänts av 33D1-antikroppen) proteiner ^3,4. CD8a ^Pos DC är också kända som CDC1, är positiva för DEC205, men negativt för myeloida markörer som CD11b och 33D1. CD8a ^Neg DC, även kallad cdc2, är positiva för 33D1, CD11b och CD4 men saknar DEC205. Den dubbla negativa delmängd (dvs negativ för både CD4 och CD8a) är relativt sällsynt, och är negativ för DEC205 och 33D1. Det är den minst karakteriserade delmängd och kan vara en mindre differentierad form av CD8a ^Neg DC.

Fenotypiska skillnader i olika DC delmängder omfattar även deras in vivo funktioner. CD8a ^Neg DC är mycket fagocytiska och tros presentera exogen antigen huvudsakligen via MHC klass II till CD4 T-celler ^3. I motsats härtill CD8a ^Pos DCs är specialiserade för presentation av lösligt protein antigen på MHC klass Ii en mekanism som kallas cross-presentation. Resultatet av kors presentation beror på aktiveringsstatus av dessa DC ^5, och kan antingen leda till expansion av cytotoxiska T-celler (CTL) eller utveckling av regulatoriska T-celler ^{6 2,7.} Inriktning av antigen till CD8a ^Pos DC med hjälp av anti-DEC205-antikroppsmedierade leveransresultat i stort sett borttagningen av T-celler ^8, medan presentation av antigener härledda från infekterade apoptotiska celler inducerar ett starkt CTL-svar ^9.

Förutom erkännande av peptidantigener, har däggdjurs immunsystem utvecklats för att känna igen lipid och glykolipid antigener. Dessa antigener presenteras av CD 1-molekyler, vilka är MHC klass I-liknande cellytproteiner som finns i flera relaterade former i olika däggdjur. Hos möss, är ansvarig för presentation av glykolipid antigener ¹⁰ en enda typ av högkonserverade CD1 molekyl som kallas CD1d. den stora population av T-celler som känner igen CD1d / glykolipid komplex kallas invariant NKT-celler (inkt celler). Dessa celler uttrycker en halv invariant T-cellsreceptor (TCR) som består av en invariant TCRα kedja som är ihopkopplade med TCRβ kedjor som har begränsad mångfald ^11. Till skillnad från konventionella T-celler som behöver föröka sig och differentiera för att bli aktiverade T-celler, existerar inkt celler som en effektor befolkningen och börja reagera snabbt efter glykolipid administration ^12. Identifiering av fysiologiskt relevant lipid antigenpresenterande celler är ett aktivt forskningsområde, och flera olika celltyper såsom B-celler, makrofager och DC har föreslagits för att utföra denna funktion. Emellertid visades det att den CD8a ^Pos delmängd av DC: er är den primära cellen som medierar upptaget och presentation av lipid antigener mot mus inkt celler ¹³ och glykolipid medierad tvär primning av CD8 T-celler ^14.

ove_content "> För att jämföra effektiviteten av antigenpresentation av olika antigenpresenterande celler, är en okomplicerad metod för att överföra olika typer av renade APC pulserade med ekvivalenta mängder av antigen i naiva värdar. Cell överförings experiment av denna typ är ofta utförda för immunologiska studier. Men utför överföringsstudier med ex vivo antigen behandlad DC är utmanande, eftersom dessa celler existerar som sällsynta populationer i lymfoida organ där de utgör mindre än 2% av de totala celler ^15. det är därför nödvändigt att främja utvecklingen av dessa celler i donatordjur att öka effektiviteten hos isoleringsprotokoll.

Det är känt att den gemensamma lymfatisk och gemensamma myeloida stamceller, som erfordras för generering av PDC CD8 ^Pos och CD8 ^Neg DC delmängder, express fms-relaterade receptor tyrosinkinas 3 (Flt-3). Vid in vivo Flt-3-ligand (Flt-3L) administration, emigration av Flt-3 uttrycker progenitorceller från benmärg ökas, vilket resulterar i ökad odling av perifera lymfoida organ och utvidgning av deras mogna DC avkomma ^16. Expression av Flt-3 förloras under engagemang för B, T eller NK celldifferentiering vägar. Därför är endast minimala förändringar observerades i dessa celler vid Flt-3L administration. Liknande expansion i DC populationer har observerats i möss som bär tumörer som genereras av implantation av en B16-melanom cellinje utsöndrar murin Flt-3L, vilket ger en enkel och billig metod för att tillhandahålla ihållande systemiska nivåer av Flt-3L ^17,18. Med hjälp av denna metod har vi utvecklat ett protokoll baserat på implantation av B16-melanomceller utsöndrar Flt-3L för att stimulera utbyggnaden av alla normala DC delmängder i musmjälte, vilket avsevärt ökar utbytena av dessa celler som kan isoleras för efterföljande experiment . Vi finner genomgående att inom 10 – 14 dagar efter subkutan implantering av Flt-3 utsöndrar tumör, möss utvecklar splenomegali med markant anrikning av DC utgöra 40-60% av den totala mjältceller. Från dessa mjältar kan olika DC delmängder isoleras med hög renhet genom att använda standard kommersiellt tillgängliga cell renings kit som använder delmängd specifika fenotypiska markörer.

Protocol

Djurförsök görs i enlighet med godkända riktlinjer från den institutionella djurvård och användning kommitté (IACUC). Alla procedurer som kräver sterilitet utförs i en biosäkerhet skåp. 1. Implantation av B16.Flt3L Melanom hos möss Kultur Flt-3 som uttrycker B16-melanom-cellinjen i T25 kolvar för vävnadsodling vid en densitet av 0,5 x 10 6 celler / ml i komplett DMEM-medium med 10% CO2 vid 37 ° C. Växa tills cellerna når ~ 90% konfluens (~ 2…

Representative Results

Resultatet av detta förfarande är beroende på utbyggnaden av DC delmängder av murin Flt-3L uttrycktes av de implanterade melanomceller. Den B16.Flt3L tumör erhölls från en C57BL / 6 mus, och bör implanteras i djur med denna stam bakgrund för att undvika fel i tumören att etablera på grund av avslag. I vissa fall kan det vara önskvärt att använda genetiskt modifierade möss för att härleda DC: er med kända defekter i signalvägar eller receptorer av intresse. Det är vikt…

Discussion

Dendritiska celler är accepterade för att vara den stora professionella antigenpresenterande celler som är involverade i primning av T-cellssvar. Deras huvudsakliga funktion är att kartlägga vävnaden mikro genom att ta upp och bearbeta antigener för presentation till T-celler. För att studera funktionen av specifika DC delmängder, dessa måste isoleras i tillräckligt antal med hjälp av en metod som bibehåller sin normala fenotyp och funktioner. De flesta protokoll förlitar sig på isolering av specifika DC …

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al. ,2000
Serum free DMEM and RPMI media
500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)     5 ml HEPES Buffer (1 M)     5 ml L-glutamine (200 mM)  0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.  Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer:			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-			2,000 Units of collagenase activity per ml This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use