Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.
Dendritiska celler (DC) är professionella antigenpresenterande celler i första hand orsakar att förvärva, bearbeta och presentera antigener på antigenpresenterande molekyler för att initiera T-cellförmedlad immunitet. Dendritiska celler kan separeras i flera fenotypiskt och funktionellt heterogena delmängder. Tre viktiga delmängder av mjälte dendritiska celler är plasmacytoid, CD8a Pos och CD8a Neg celler. De plasmacytoid DCs är naturliga producenter av typ I interferon och är viktiga för antiviral T-cellimmunitet. CD8a Neg DC delmängd är specialiserad för MHC klass II antigenpresentation och är centralt involverad i priming CD4 T-celler. CD8a Pos DC är primärt ansvariga för kors presentation av exogena antigener och CD8 T-cell priming. CD8a Pos DCs har visat sig vara mest effektiv vid presentationen av glykolipid antigener genom CD1d molekyler till en specialiserad T cell befolkning kallas invariant naturliga mördar T (inkt) celler. Administration av Flt-3 ligand ökar frekvensen av migration av dendritiska celler stamceller från benmärg, vilket slutligen resulterar i expansion av dendritiska celler i perifera lymfoida organ i musmodeller. Vi har anpassat denna modell för att rena stora mängder av funktionella dendritiska celler för användning i cellöverförings experiment för att jämföra in vivo kunskaper olika DC delmängder.
Dendritiska celler (DC) upptäcktes nästan fyrtio år sedan som "stora stel (grekiska kvistar) cell" som finns i lymfoida organ 1. Många studier har visat att DC: er är de enda antigenpresenterande celler som effektivt kan stimulera naiva T-celler 2. En viktig funktion av dessa celler är upptaget och presentation av antigener och effektiv behandling och lastning av dessa på antigenpresenterande molekyler. I musmjälte kan DCs delas in plasmacytoid och konventionella delmängder. De plasmacytoid DC kännetecknas av lågt uttryck av CD11c och höga nivåer av B220 och Gr-1. De är också positivt för ytmarkör mPDCA1 och utsöndrar typ I interferon som svar på toll like receptor 9 (TLR9) ligander. De konventionella DC är höga för CD11c och MHC klass II uttryck. De kan delas upp i tre distinkta undergrupper baserade på ytexpression av fenotypiska markörer såsom CD4, CD8a, DEC205, CD11b och dendritiska celler hämmande receptor 2 (DCIR2, erkänts av 33D1-antikroppen) proteiner 3,4. CD8a Pos DC är också kända som CDC1, är positiva för DEC205, men negativt för myeloida markörer som CD11b och 33D1. CD8a Neg DC, även kallad cdc2, är positiva för 33D1, CD11b och CD4 men saknar DEC205. Den dubbla negativa delmängd (dvs negativ för både CD4 och CD8a) är relativt sällsynt, och är negativ för DEC205 och 33D1. Det är den minst karakteriserade delmängd och kan vara en mindre differentierad form av CD8a Neg DC.
Fenotypiska skillnader i olika DC delmängder omfattar även deras in vivo funktioner. CD8a Neg DC är mycket fagocytiska och tros presentera exogen antigen huvudsakligen via MHC klass II till CD4 T-celler 3. I motsats härtill CD8a Pos DCs är specialiserade för presentation av lösligt protein antigen på MHC klass Ii en mekanism som kallas cross-presentation. Resultatet av kors presentation beror på aktiveringsstatus av dessa DC 5, och kan antingen leda till expansion av cytotoxiska T-celler (CTL) eller utveckling av regulatoriska T-celler 6 2,7. Inriktning av antigen till CD8a Pos DC med hjälp av anti-DEC205-antikroppsmedierade leveransresultat i stort sett borttagningen av T-celler 8, medan presentation av antigener härledda från infekterade apoptotiska celler inducerar ett starkt CTL-svar 9.
Förutom erkännande av peptidantigener, har däggdjurs immunsystem utvecklats för att känna igen lipid och glykolipid antigener. Dessa antigener presenteras av CD 1-molekyler, vilka är MHC klass I-liknande cellytproteiner som finns i flera relaterade former i olika däggdjur. Hos möss, är ansvarig för presentation av glykolipid antigener 10 en enda typ av högkonserverade CD1 molekyl som kallas CD1d. den stora population av T-celler som känner igen CD1d / glykolipid komplex kallas invariant NKT-celler (inkt celler). Dessa celler uttrycker en halv invariant T-cellsreceptor (TCR) som består av en invariant TCRα kedja som är ihopkopplade med TCRβ kedjor som har begränsad mångfald 11. Till skillnad från konventionella T-celler som behöver föröka sig och differentiera för att bli aktiverade T-celler, existerar inkt celler som en effektor befolkningen och börja reagera snabbt efter glykolipid administration 12. Identifiering av fysiologiskt relevant lipid antigenpresenterande celler är ett aktivt forskningsområde, och flera olika celltyper såsom B-celler, makrofager och DC har föreslagits för att utföra denna funktion. Emellertid visades det att den CD8a Pos delmängd av DC: er är den primära cellen som medierar upptaget och presentation av lipid antigener mot mus inkt celler 13 och glykolipid medierad tvär primning av CD8 T-celler 14.
ove_content "> För att jämföra effektiviteten av antigenpresentation av olika antigenpresenterande celler, är en okomplicerad metod för att överföra olika typer av renade APC pulserade med ekvivalenta mängder av antigen i naiva värdar. Cell överförings experiment av denna typ är ofta utförda för immunologiska studier. Men utför överföringsstudier med ex vivo antigen behandlad DC är utmanande, eftersom dessa celler existerar som sällsynta populationer i lymfoida organ där de utgör mindre än 2% av de totala celler 15. det är därför nödvändigt att främja utvecklingen av dessa celler i donatordjur att öka effektiviteten hos isoleringsprotokoll.Det är känt att den gemensamma lymfatisk och gemensamma myeloida stamceller, som erfordras för generering av PDC CD8 Pos och CD8 Neg DC delmängder, express fms-relaterade receptor tyrosinkinas 3 (Flt-3). Vid in vivo Flt-3-ligand (Flt-3L) administration, emigration av Flt-3 uttrycker progenitorceller från benmärg ökas, vilket resulterar i ökad odling av perifera lymfoida organ och utvidgning av deras mogna DC avkomma 16. Expression av Flt-3 förloras under engagemang för B, T eller NK celldifferentiering vägar. Därför är endast minimala förändringar observerades i dessa celler vid Flt-3L administration. Liknande expansion i DC populationer har observerats i möss som bär tumörer som genereras av implantation av en B16-melanom cellinje utsöndrar murin Flt-3L, vilket ger en enkel och billig metod för att tillhandahålla ihållande systemiska nivåer av Flt-3L 17,18. Med hjälp av denna metod har vi utvecklat ett protokoll baserat på implantation av B16-melanomceller utsöndrar Flt-3L för att stimulera utbyggnaden av alla normala DC delmängder i musmjälte, vilket avsevärt ökar utbytena av dessa celler som kan isoleras för efterföljande experiment . Vi finner genomgående att inom 10 – 14 dagar efter subkutan implantering av Flt-3 utsöndrar tumör, möss utvecklar splenomegali med markant anrikning av DC utgöra 40-60% av den totala mjältceller. Från dessa mjältar kan olika DC delmängder isoleras med hög renhet genom att använda standard kommersiellt tillgängliga cell renings kit som använder delmängd specifika fenotypiska markörer.
Dendritiska celler är accepterade för att vara den stora professionella antigenpresenterande celler som är involverade i primning av T-cellssvar. Deras huvudsakliga funktion är att kartlägga vävnaden mikro genom att ta upp och bearbeta antigener för presentation till T-celler. För att studera funktionen av specifika DC delmängder, dessa måste isoleras i tillräckligt antal med hjälp av en metod som bibehåller sin normala fenotyp och funktioner. De flesta protokoll förlitar sig på isolering av specifika DC …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH / NIAID bidrag AI45889 till SAP Flödescytometri studier genomfördes med hjälp av FACS kärnanläggningar som stöds av Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) och Centrum för AIDS Research (NIH / NIAID AI51519).
0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
1 ml syringes | BD | 26048 | |
23 G1 needle | BD | 305145 | |
100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
Cell strainer (70 µm | BD | 352350 | |
Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um | Corning | 431097 | |
LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al. ,2000 | ||
Serum free DMEM and RPMI media | |||
500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
MACS buffer: | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000- |
2,000 Units of collagenase activity per ml This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use |