Glaukom-inducerende Procedure i en<em> In vivo</em> Rat Model og Whole-mount Retina Forberedelse

Summary

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Abstract

Glaukom er en sygdom i centralnervesystemet påvirker retinale ganglieceller (RGC'er). RGC axoner udgør synsnerven bære visuelt input til hjernen for visuelle opfattelse. Skader på RGC'er og deres axoner fører til synstab og / eller blindhed. Selvom de specifikke årsag glaukom er ukendt, den primære risikofaktor for sygdommen er en forhøjet intraokulært tryk. Glaukom-fremkaldende procedurer i dyremodeller er et værdifuldt redskab for forskere studerer den mekanisme af RGC død. Sådanne oplysninger kan føre til udvikling af effektive neurobeskyttende behandlinger, der kunne hjælpe i forebyggelsen af ​​synstab. Protokollen i dette papir beskrives en fremgangsmåde til induktion af glaukom – ligesom forholdene i en in vivo rottemodel hvor 50 pi 2 M hypertonisk saltvand injiceres i episcleral venøse plexus. Blanchering af skibene indikerer vellykket injektion. Denne procedure medfører tab af RGC'er at simulere glaukom. Én måned efterinjektion blev dyrene aflivet, og øjne fjernes. Dernæst hornhinden, linsen og glaslegemet fjernet for at gøre en øjestykket. Nethinden derpå skrællet fra bagsiden af ​​øjet og fastgjort på Sylgard retter med cactus nåle. På dette tidspunkt kan neuroner i nethinden farves til analyse. Resultater fra dette laboratorium viser, at ca. 25% af RGC'er er tabt inden for en måned af proceduren i forhold til de interne kontroller. Denne procedure giver mulighed for kvantitativ analyse af retinal ganglion celledød i en in vivo rotte glaukom model.

Introduction

Glaukom er en gruppe af øjensygdomme påvirker neuroner i nethinden, specifikt angår den retinale ganglieceller ^1-2. Axoner af disse celler konvergere at blive synsnerven transporterer visuel information til hjernen, hvor synet opfattes. Skader på RGC'er og deres axoner forårsager derfor visuelle defekter.

De primære egenskaber i tilknytning til glaukom lidelser er RGC degeneration og død, forhøjet intraokulært tryk (IOP), og optisk disk cupping og atrofi. Disse træk fører til synstab felt eller fuldstændig irreversibel blindhed. I øjeblikket har glaukom forårsaget blindhed i 70 millioner mennesker på verdensplan ^3. Som sådan, det er verdens tredjestørste årsag til blindhed ^4.

Den nøjagtige mekanisme af RGC død i glaukom fortsat ukendt. Megen forskning er blevet gjort for at låse mysteriet. Det er imidlertid kendt, at den primære risikofaktor for grøn stær er en stigning in intraokulære tryk på grund af uregelmæssig cirkulation af kammervæske (AH) i det forreste kammer i øjet. AH fungerer som en transparent og farveløs erstatning for blod i avaskulære forreste kammer i øjet. Det nærer de omkringliggende celler, fjerner udskilte affaldsprodukter fra metaboliske processer, transporterer neurotransmittere, og tillader cirkulation af narkotika og inflammatoriske celler i øjet under patologiske tilstande ^1.

Opretholdelsen af ​​kammervand cirkulation involverer corpus ciliare og trabekelværket. Kammervand produceres af corpus ciliare. Det strømmer så ind i det forreste kammer for at opretholde den generelle sundhed i det okulære væv. 75 – 80% af kammervand udstrømning aktivt secerneres gennem ikke-pigmentglaukom ciliære epitel når fluidet filtreres gennem tre lag af svampet væv i den ciliære muskel. Fluidet kommer ud gennem trabekelværket og gennem Schlemm Kanal som træde i stedet forerne i blodsystemet ⁵ .Den resterende 20 – 25% af udstrømning omgår trabekelværket og passivt udskilles af ultrafiltrering og diffusion gennem uveo-sclerale pathway. Denne vej synes at være relativt uafhængig af intraokulært tryk ^1.

Når vandvæskeproduktionen og udstrømning er ude af balance, trykket opbygges inde i øjet. Som nævnt, denne stigning i intraokulært tryk er den primære risikofaktor i udviklingen af ​​glaukom. Sådant tryk medfører skade på indviklede lag af neuroner i nethinden bagerst i øjet. Skader på retina ganglieceller axoner af synsnerven får hjernen til at ikke længere modtage nøjagtig visuel information. Som følge heraf er opfattelsen af ​​synet tabt og fuldstændig blindhed kan forekomme.

Til dato er der ingen kur mod grøn stær. Forskellige behandlingsmetoder findes der primært sigter mod at reducere det intraokulære tryk. Disse omfatter aktueltmedicin klasser såsom beta1-adrenerge receptorblokkere eller aktuelle prostaglandin analoger. Beta-blokkere reducerer det intraokulære tryk ved at reducere produktionen af kammervand ^7. Prostaglandiner funktion at reducere IOP ved at øge udstrømningen af vandig humor ^8-14. Alfa-adrenerge agonister og kulsyreanhydrasehæmmere anvendes også som sekundære behandlingsmetoder. Alfa-adrenerge agonister øger udstrømning gennem uveosclerale pathway ^15-17. Carboanhydrasehæmmere reducere produktionen af AH ved enzymatisk hæmning ^18. Meget mere invasive procedurer anvendes også til behandling af glaukom. Laser trabeculoplasty bruges til at øge udstrømningen af vandig humor ^19. En anden kirurgisk terapi, kaldet trabekulektomi, skaber en alternativ drænage site at filtrere AH når den traditionelle trabekulære pathway bliver blokeret ^20-21.

Disse behandlingsmuligheder har været kendt for effectively reducere IOP. Men op til 40% af glaukom patienter viser normale IOP niveauer indikerer et behov for mere komplette terapeutiske metoder. ^22,23 Derudover retinal ganglion celledød set i grøn stær er irreversibel, når det begynder og nuværende behandlinger ikke stoppe progressionen af sygdommen ^24-28. Det har understreget behovet for effektive neurobeskyttende behandlingsformer, der er målrettet overlevelsen af ​​neuroner selv. Udvikling af glaukom modeller er afgørende for denne udvikling.

I denne undersøgelse viser vi en fremgangsmåde til induktion glaukom-lignende virkninger i voksne Long Evans-rotter under anvendelse af en modificeret procedure oprindeligt skitseret af Morrison ^29. I denne procedure, injektioner af 2 M hypertonisk saltvand ind i episcleral venøse plexus inducerer glaukom-lignende tilstande ved ardannelse væv for at reducere kammervæske udstrømning i trabekelværket fører til en stigning i intraokulært tryk og et betydeligt tab af RGC'er wnden en måned efter proceduren ^30-31. Glaukom-fremkaldende procedurer, som den her beskrevne, kan være nøglen til at frigøre nye udviklinger i glaukom behandlinger.

Protocol

Alle procedurer ved hjælp af dyr emner har været i overensstemmelse med de standarder for Institute of Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Western Michigan University. 1. Dyr Bruge han- og hunrotter 3 måneder gamle i denne undersøgelse. Holde dyr i en 12 timers lys / mørke-cyklus med fri adgang til foder og vand. 2. Udarbejdelse af KAX Cocktail for Animal Anæstesi Opløs 50 mg xylazin (20 mg / ml) i 5 ml ketamin (100…

Representative Results

Dette afsnit illustrerer apparatet komponenter og procedure anvendes til at fremkalde glaukom-lignende forhold i en in vivo rotte glaukom model. Vi viser de enkelte værktøjer og udstyr, der anvendes til at udføre en hypertonisk saltvand injektion som forårsager en stigning i intraokulært tryk. Vi viser injektion i episcleral venøse plexus med det karakteristiske blanchering virkning og uklart udseende af det forreste kammer, der resulterer. Vi beskriver også processen med…

Discussion

Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til induktion glaukom-lignende forhold i en in vivo rottemodel. Denne procedure anvender en injektion af hypertonisk saltvand til at inducere ardannelse i trabekelværket ^{29, 32.} Udvikling arvæv okkluderer udstrømningen af kammervæske, som forøger trykket i det forreste kammer. Med nedsat udstrømning og trykopbygning, linsen suspenderet af elastiske ledbånd skubber tilbage i den glasagtige kammer. Glaslegemet gælder så tryk på nethinden beskadige de…

Materials

Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 mL bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/mL	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 mL bottle
Serum bottle, 10 mL	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 mL insulin syringe	VWR	BD329410	28 gauge needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 mL  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade # 11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 mL graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles	N/A	N/A
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 mL	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75×25
Glycerol	Sigma	G5516-100 mL	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti