Glaukom-induserende prosedyre i en<em> I Vivo</em> Rat Model og Whole-mount Retina Forberedelse

Summary

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Abstract

Grønn stær er en sykdom i sentralnervesystemet som påvirker gangliecelle (RGCs). RGC aksoner som utgjør synsnerven bære visuelle input til hjernen for visuell persepsjon. Skade på RGCs og deres aksoner fører til synstap og / eller blindhet. Selv om den spesifikke årsaken til glaukom er ukjent, er den primære risikofaktoren for sykdommen er en forhøyet intraokulært trykk. Glaukom-induserende prosedyrer i dyremodeller er et verdifullt verktøy for forskere som studerer mekanismen av RGC død. Slik informasjon kan føre til utvikling av effektive nevrobeskyttende behandlinger som kan hjelpe til å forebygge synstap. Protokollen i dette dokumentet beskriver en fremgangsmåte for å indusere glaukom – lignende forhold i en in vivo rottemodell hvor 50 pl av 2 M hypertonisk saltløsning injiseres inn i episcleral venous plexus. Blanchering av fartøyene indikerer vellykket injeksjon. Denne prosedyren fører til tap av RGCs å simulere glaukom. En måned etterinjeksjon, blir dyrene avlivet og øynene er fjernet. Deretter blir hornhinnen, linsen og glasslegemet fjernes for å gjøre en øyemusling. Netthinnen er deretter skrelles fra baksiden av øyet og festet på Sylgard retter med kaktus nåler. På dette punktet, kan nevroner i netthinnen bli farget for analyse. Resultater fra dette laboratoriet viser at ca 25% av RGCs er tapt innen en måned etter inngrepet i forhold til internkontroll. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for kvantitativ analyse av gangliecelle død i en in vivo-rottemodellen glaukom.

Introduction

Grønn stær er en gruppe av øyesykdommer som påvirker nervecellene i netthinnen, spesifikt, gangliecelle ^1-2. Aksonene av disse cellene konvergerer til å bli den optiske nerven bære visuell informasjon til hjernen hvor synet oppfattes. Skade på RGCs og deres aksoner fører derfor visuelle defekter.

Den primære egenskaper knyttet til glaukom lidelser er RGC degenerasjon og død, økt intraokulært trykk (IOP), og optisk disk kopping og atrofi. Disse funksjonene føre til tap av synsfelt eller fullstendig, irreversibel blindhet. Foreløpig har glaukom forårsaket blindhet i 70 millioner mennesker verden over ^3. Som sådan, er det verdens tredje største årsaken til blindhet ^4.

Den eksakte mekanismen for RGC død i glaukom er ukjent. Mye forskning har blitt gjort for å løse mysteriet. Det er imidlertid kjent at den primære risikofaktoren av glaukom er en økning in intraokulært trykk på grunn av uregelmessig sirkulasjon av vandig humor (AH) i det fremre kammer av øyet. AH fungerer som en gjennomsiktig og fargeløst erstatning for blod i avascular fremre kammer av øyet. Det gir næring til omkringliggende cellene, fjerner utskilte avfallsprodukter fra stoffskiftet, transporterer nevrotransmittere, og tillater sirkulasjon av narkotika og inflammatoriske celler i øyet under patologiske tilstander ^1.

Vedlikehold av kammer sirkulasjon innebærer ciliarkropp og trabekelverket. Vandig humor er produsert av ciliarkropp. Den strømmer deretter inn i det fremre kammer for å opprettholde den generelle helsen til okulært vev. 75 – 80% av vandig humor utstrømning aktivt utskilt gjennom ikke-pigmentært ciliarepitelet når fluidet filtreres gjennom tre lag av svampaktig vev i siliærmuskel. Væsken ut gjennom trabekelverket og gjennom Schlemm Canal som gripertallet inn i blodsystemet ^fem sikret resterende 20 – 25% av utstrømming forbigår trabekelverket og passivt skilles ut av ultrafiltrering og spredning gjennom uveo-skleral veien. Denne reaksjonsvei synes å være forholdsvis uavhengig av intraokulært trykk ^1.

Når vandig humor produksjon og utstrømning er ute av balanse, trykket bygger i øyet. Som nevnt, er denne økningen i intraokulært trykk den primære risikofaktor i utviklingen av grønn stær. Slikt trykk forårsaker skade på intrikate lag av nevroner i netthinnen ved den bakre del av øyet. Skader på gangliecelle aksoner av synsnerven får hjernen til å ikke lenger motta nøyaktig visuell informasjon. Som et resultat, er oppfatningen av syn tapt og fullstendig blindhet kan forekomme.

Til dags dato er det ingen kur for glaukom. Ulike behandlingsmetoder finnes som først og fremst tar sikte på å redusere intraokulært trykk. Disse inkluderer aktuellmedisinering klasser som beta1-adrenerge reseptorblokkere, eller aktuelle prostaglandinanaloger. Betablokkere reduserer intraokulært trykk ved å redusere produksjon av vandig humor ^7. Prostaglandiner fungere for å redusere IOP ved å øke drenasjen av kammervann ^8-14. Alfa-adrenerge agonister og karboanhydrasehemmere blir også brukt som sekundære fremgangsmåter for behandling. Alpha adrenerge agonister øke utstrømningen gjennom uveoskleral vei ^15-17. Karboanhydrasehemmere redusere produksjonen av AH ved enzymatisk inhibering ^18. Mye mer invasive prosedyrer blir også brukt til å behandle glaukom. Laser tabekuloplasti brukes til å øke utstrømningen av vandig humor ^19. En annen kirurgisk behandling, kalt trabeculectomy, skaper en alternativ drenerings området for å filtrere AH når den tradisjonelle trabekulært veien er blokkert ^20-21.

Disse behandlingsalternativene har vært kjent for å effectively redusere IOP. Men opp til 40% av glaukom pasientene viser normale IOP nivåer indikerer et behov for mer komplette terapeutiske metoder. ^22,23 tillegg er gangliecelle død sett i glaukom irreversibel når den begynner og nåværende behandlinger ikke stoppe utviklingen av sykdommen ^24-28. Dette har aktualisert behovet for effektive nervecellene behandlinger som er rettet mot overlevelse av nevronene selv. Utvikling av glaukom modeller er avgjørende for denne utviklingen.

I denne studien viser vi en fremgangsmåte for å indusere glaukom-lignende effekter hos voksne Long Evans-rotter ved anvendelse av en modifisert prosedyre som opprinnelig er beskrevet av Morrison ^29. I denne prosedyren, injeksjoner med 2 M hypertonisk saltløsning inn i episcleral venøse pleksus induserer glaukom-lignende betingelser ved arr vev for å redusere vannvæske utstrømning i trabekelverket som fører til en økning i intraokulært trykk og et betydelig tap av RGCs wTVen på en måned av prosedyren ^30-31. Glaukom-induserende prosedyrer, slik som den er beskrevet her, kan være nøkkelen til å låse opp nye utbygginger i glaukom behandlinger.

Protocol

Alle prosedyrer som bruker dyr fag har vært i samsvar med kravene i den Institute of Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Western Michigan University. 1. Dyr Bruk hann- og hunnrotter 3 måneders alder i denne studien. Holde dyr i en 12 timers lys / mørke syklus med fri tilgang til mat og vann. 2. Utarbeidelse av KAX Cocktail for Animal Anesthesia Oppløs 50 mg xylazin (20 mg / ml) i 5 ml ketamin (100 mg / ml) med 1 ml …

Representative Results

Dette avsnittet illustrerer apparatet komponenter og prosedyre som brukes til å indusere glaukom lignende forhold i en in vivo rotte glaukom modell. Vi viser de enkelte verktøy og utstyr som brukes til å utføre en hyperton saltvanns injeksjon som fører til en økning i intraokulært trykk. Vi viser injeksjon i episcleral venous plexus med sin karakteristiske bleking effekt og uklart utseende av den fremre kammer som resultat. Vi beskriver også prosessen med retina fjerning…

Discussion

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å indusere glaukom lignende forhold i en in vivo-rottemodellen. Denne fremgangsmåten bruker en injeksjon av hyperton saltvannsoppløsning for å indusere arrdannelse i trabekelverket ^{29, 32.} Utvikling arrvev tetter utløpet av kammervann som øker trykket i fremre kammer. Med redusert strøm og trykkoppbygging, linsen opphengt ved hjelp av elastiske ligamenter skyver tilbake inn i glasskammeret. Glasslegemet gjelder da press på netthinnen skade den…

Materials

Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 mL bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/mL	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 mL bottle
Serum bottle, 10 mL	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 mL insulin syringe	VWR	BD329410	28 gauge needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 mL  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade # 11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 mL graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles	N/A	N/A
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 mL	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75×25
Glycerol	Sigma	G5516-100 mL	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti