Produktion av Human Norovirus utskjutande domäner i<em> E. coli</em> För röntgenkristallografi
Summary
Här beskriver vi en metod för att uttrycka och rena hög kvalitet norovirus utskjutande (P) domäner i E. coli för användning i röntgenkristallografi-studier. Denna metod kan tillämpas på andra calicivirus P domäner, såväl som icke-strukturella proteiner, det vill säga., Viralt protein genomet bunden (VPG), proteas, och RNA-beroende RNA-polymeras (RdRp).
Abstract
Norovirus kapsiden består av en enda stor strukturell protein, benämnt VP1. VP1 är indelad i ett skal (S) domän och en utskjutande (P) domänen. S-domänen bildar en sammanhängande byggnadsställning runt virala RNA, medan P domän bildar virala spikar på S-domänen och innehåller bestämningsfaktorer för antigenicitet och värd-cellinteraktioner. P domänen binder kolhydratstrukturer, dvs., Till histo-blodgruppsantigener, som tros vara viktiga för norovirusinfektioner. I detta protokoll, beskriver vi en metod för att producera högkvalitativa norovirus P domäner i höga utbyten. Dessa proteiner kan sedan användas för röntgenkristallografi och ELISA för att studera antigenicitet och värd-cellinteraktioner.
P domänen är för det första klonas in i en expressionsvektor och därefter uttryckas i bakterier. Proteinet renas med användning av tre steg som involverar immobiliserade metall-jon-affinitetskromatografi och storleksuteslutningskromatografi. Iprincip är det möjligt att klona, uttrycka, rena och kristallisera proteiner i mindre än fyra veckor, vilket gör detta protokoll ett snabbt system för analys av nya framväxande stammar norovirus.
Introduction
Humana norovirus är den största orsaken till akut gastroenterit i hela världen 1. Dessa virus tillhör Caliciviridae familjen, av vilka det finns minst fem släkten, däribland Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus och Nebovirus. Trots sin höga effekt på vården och bred distribution, är studiet av mänskliga norovirus hämmas av bristen på en robust cellodlingssystem. Hittills finns det inga godkända vacciner eller antivirala strategier tillgängliga.
Norovirus huvudsakliga kapsidproteinet, benämnd VP1, kan delas in i ett skal (S) domän och en utskjutande (P) domänen 2. P-domänen är ansluten till S-domänen av ett flexibelt gångjärn (H) region. S-domänen bildar en byggnadsställning runt det virala RNA: t, medan det P-domänen bildar den yttersta delen av den virala kapsiden. P-domänen samman i biologiskt relevanta dimerer när det uttrycks i bakterier. P dimer samverkar med kolhydratstrukturer, benämnd histo-blodgruppsantigener (HBGAs) som finns som lösliga antigener i saliv och återfinns på vissa värdceller 3. P domän HBGA interaktion tros vara viktigt för infektion 4. I själva verket visade en färsk rapport om vikten av syntetiska HBGAs eller HBGA uttryckande bakterier för humant norovirusinfektion in vitro 5.
Aktuella studier om värdfästcellen av norovirus i huvudsak utförs med viruslika partiklar (VLP) som kan uttryckas i insektsceller eller med rekombinanta P domäner uttrycks i Escherichia coli (E. coli). För att förstå P domän HBGA samverkan på atomär upplösning, kan P domän HBGA komplexa strukturer lösas med hjälp av röntgenkristallografi. Här beskriver vi ett protokoll för P domän expression och rening som gör att produktionen av P-domän i hög kvantitet och kvalitet för att användas för röntgen crystallography. Dessutom kan denna metod användas för andra calicivirus P domäner och icke-strukturella proteiner.
P domänen är kodon-optimerad för E. coli expressions och klonades in i en standard överföringsvektor. P domänen är sedan åter klonas in i en expressionsvektor som kodar för en polyhistidin (His) -märkningen och ett mannosbindande protein (MBP) som följs av ett proteas klyvningsstället. MBP-His-P-domän-fusionsprotein uttrycks i E. coli, följt av tre reningssteg. MBP-His-P domänfusionsprotein renas med användning av immobiliserad metalljon-affinitetskromatografi (IMAC). Därefter fusionsproteinet klyvs med humant rhinovirus (HRV) 3C-proteas och P-domänen separeras från MBP-His genom ett ytterligare IMAC reningssteg. Slutligen är P-domänen renades med användning av storlekssorterande kromatografi (SEC). Det renade P-domänen kan sedan användas för röntgenkristallografi. Screening av proteinkristallisationsbetingelser är performed med kommersiellt tillgängliga screening kit med olika P domänproteinkoncentrationer. Kristalltillväxt observeras och de mest lovande förutsättningar optimeras.
Med de metoder som beskrivs här, är det möjligt att gå från gen till protein för att strukturera inom mindre än fyra veckor. Därför är vårt sätt att P-domänen uttryck, rening och kristallisation lämplig att studera norovirus-värd samverkan på molekylär nivå och ger viktiga data för att hjälpa till up-to-date vaccin design och läkemedelsscreening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för uttryck och rening av norovirus P domäner i hög kvalitet och kvantitet. Norovirus är inte väl studerat och strukturdata kontinuerligt behövs. Såvitt vi vet har domän produktion P med hjälp av andra protokoll (t.ex. GST-märkt P domäner) varit problematiskt, så långt, och tillräckliga strukturella uppgifter om norovirus-värd interaktion har saknats. Med den metod som beskrivs här, har vi nyligen bidragit väsentligt till förståelsen av de molekylära detaljern…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.
Materials
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 cm x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
References
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).
- Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
- Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
- Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
- Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
- Mccoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
- Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
- Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses’ fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
- Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).
