Produzione di Norovirus umani sporgenti Domini in<em> E. coli</em> Per la cristallografia a raggi X
Summary
Qui, descriviamo un metodo per esprimere e purificare norovirus di alta qualità sporgenti (P) domini in E. coli per l'utilizzo in studi di cristallografia a raggi X. Questo metodo può essere applicato ad altri domini calicivirus P, così come le proteine non-strutturali, cioè., Proteina virale genoma-linked (VPG), proteasi, e RNA RNA dipendente polimerasi (RdRp).
Abstract
Il capside norovirus è composto da una singola proteina strutturale principale, denominato VP1. VP1 è suddiviso in un guscio (S) dominio e un dominio sporgenti (P). Il dominio S forma una impalcatura contigua intorno l'RNA virale, mentre le forme di dominio P picchi virali sul dominio S e contiene determinanti per antigenicità e host-cellule interazioni. Il dominio P lega strutture di carboidrati, ad esempio., Antigeni del gruppo isto-sangue, che si pensa siano importanti per le infezioni norovirus. In questo protocollo, si descrive un metodo per la produzione di domini norovirus P di alta qualità con rese elevate. Queste proteine possono quindi essere utilizzati per la cristallografia a raggi X ed ELISA per studiare antigenicità e host-cellule interazioni.
Il dominio P viene prima clonato in un vettore di espressione e quindi espressa in batteri. La proteina è purificata utilizzando tre fasi che coinvolgono immobilizzati metallo-ioni cromatografia di affinità e le dimensioni cromatografia di esclusione. Inlinea di principio, è possibile clonare, espresso, purificare, e cristallizzare le proteine in meno di quattro settimane, il che rende questo protocollo un sistema rapido per l'analisi dei ceppi di norovirus emergenti.
Introduction
Norovirus umani sono la principale causa di gastroenterite acuta in tutto il mondo 1. Questi virus appartengono alla famiglia Caliciviridae, di cui ci sono almeno cinque generi, tra cui Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, e Nebovirus. Nonostante il loro elevato impatto sul sistema sanitario e ampia distribuzione, lo studio dei norovirus umani è ostacolata dalla mancanza di un sistema di coltura cellulare robusto. Fino ad oggi, non ci sono vaccini autorizzati o strategie antivirali disponibili.
La proteina capside maggiore norovirus, definito VP1, può essere diviso in un guscio (S) e un dominio sporgente (P) del dominio 2. Il dominio P è collegato al dominio S da una regione cerniera flessibile (H). Il dominio S forma una impalcatura attorno alla RNA virale, mentre il dominio P costituisce la parte più esterno del capside virale. Il dominio P assembla in dimeri biologicamente rilevanti quando espresso in batteri. Il P dIMER interagisce con le strutture di carboidrati, denominati antigeni del gruppo isto-sangue (HBGAs) che sono presenti come antigeni solubili nella saliva e trovato su alcune cellule ospiti 3. L'interazione dominio HBGA P è pensato per essere importante per l'infezione 4. Infatti, un recente rapporto ha rivelato l'importanza di HBGAs sintetici o HBGA esprimono batteri per l'infezione da norovirus umano in vitro 5.
Gli studi in corso per quanto riguarda l'attaccamento cellula ospite di norovirus sono principalmente eseguiti con particelle virus-simili (VLP) che possono essere espresse in cellule di insetto o con i domini P ricombinanti espressi in Escherichia coli (E. coli). Per capire le interazioni P dominio HBGA a risoluzione atomica, strutture complesse P dominio HBGA possono essere risolti mediante cristallografia a raggi X. Qui, descriviamo un protocollo per l'espressione del dominio P e purificazione che permette la produzione di dominio P in alta quantità e qualità da utilizzare per crystall raggi Xografia. Inoltre, questo metodo può essere applicato per altri domini calicivirus P e proteine non strutturali.
Il dominio P è codone-ottimizzato per E. espressione coli e clonato in un vettore di trasferimento standard. Il dominio P viene poi ri-clonato in un vettore di espressione che codifica una polyhistidine tag (His) e una proteina legante mannosio (MBP) che sono seguiti da un sito proteasi clivaggio. Il-His-P MBP proteina di fusione del dominio è espresso in E. coli, seguita da tre fasi di purificazione. La proteina di fusione del dominio MBP-His-P viene purificato mediante cromatografia immobilizzato metallo ionica affinità (IMAC). Successivamente, la proteina di fusione viene scisso con rinovirus umano (HRV) proteasi -3C e il dominio P è separato dal MBP-His da un ulteriore passaggio di purificazione IMAC. Infine, il dominio P viene purificato mediante cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Il dominio P purificato può essere utilizzato per la cristallografia a raggi X. Proiezione delle condizioni di cristallizzazione delle proteine è perfoconfermate con i kit di screening disponibili in commercio che utilizzano differenti concentrazioni di proteine dominio P. crescita dei cristalli si osserva e le condizioni più promettenti sono ottimizzate.
Con i metodi qui descritti, è possibile passare dal gene alla proteina di strutturare in meno di quattro settimane. Pertanto, il nostro metodo di espressione P dominio, purificazione e cristallizzazione è adatto per studiare l'interazione norovirus-ospite a livello molecolare e di fornire dati importanti per aiutare nella progettazione e farmaci di screening vaccino up-to-date.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo per l'espressione e la purificazione di domini P norovirus in alta qualità e quantità. Norovirus non sono ben studiati e dati strutturali sono continuamente necessari. A nostra conoscenza, la produzione dominio P utilizzando altri protocolli (ad esempio, domini P GST-tagged) è stato problematico, fino ad ora, e dati strutturali sufficienti interazione norovirus-host sono stati dispersi. Con il metodo qui descritto, abbiamo recentemente contribuito in modo significativo alla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.
Materials
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 cm x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
References
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