Миниатюризированное Glycan Microarray Анализ для оценки авидности и специфичность вируса гриппа А агглютинины
Summary
Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Abstract
Вирус гриппа А (ИФО) гемагглютинины признают сиаловых кислот на поверхности клетки, как функциональные рецепторы, чтобы получить вход в клетки. Дикие водоплавающие являются естественным резервуаром для IAV, но IAV может пересечь видовой барьер для птицы, свиней, лошадей и людей. Вирусы птичьего признают сиаловой кислоты, прикрепленную к предпоследней галактозы с помощью α2-3 связи (рецепторы птичьего типа), тогда как человеческие вирусы предпочтительно распознавать сиаловой кислоты с α2-6 подъёмник (рецепторы человеческого типа). Для того, чтобы контролировать, если вирус птичьего адаптируются к рецепторам типа человека, могут быть использованы несколько способов. Glycan микрочипы с различными библиотеками синтетических sialosides все чаще используются для оценки специфичности рецептора. Тем не менее, этот метод не используется для измерения avidities. Измерение авидности обычно достигается путем оценки связывания серийно разведенной гемагглютинина вируса или к гликанов, адсорбированных в обычных полипропиленовых 96-луночных планшетах. В этом анализе гликаны с альфа2-3 или α2-6 сиаловых кислот, в сочетании с биотином и адсорбируют на стрептавидин пластин, или соединены с полиакриламид (ПАА), которые непосредственно адсорбироваться на пластике. Мы значительно миниатюрным этот анализ непосредственно печатание ПАА-сшитый sialosides и их не ПАА-сшитый коллегами на микро-а стеклах. Этот комплект, с 48 массивов на одном слайде, позволяет одновременно анализы 6 Гликан связывающих белков в 8 разведений, опрашивая 6 различных гликанов, в том числе двух не сиалилированных контроля. Это эквивалентно 18x 96-луночные планшеты в традиционном анализе на планшетах. Гликан формат массива уменьшается потребление соединений и биологических препаратов и тем самым значительно повышает эффективность.
Introduction
Дикие водоплавающие являются естественным резервуаром для IAV, но IAV способен пересечь видовой барьер для домашней птицы и млекопитающих, в том числе, человека. Птичий IAVS признают α2-3 связанных сиаловой кислоты (рецепторы птичьего типа), в то время как человеческие вирусы связывают α2-6 связанных сиаловой кислоты (рецепторы человеческого типа). Для того, чтобы иметь возможность эффективно копировать и передавать между людьми птичий IAV должно связываться с рецепторами человеческого типа 1.
IAVS разделены на основе серологических, характеризующей антигенность их гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) гликопротеинами оболочки. HA связывается с сиаловой кислоты, в то время как NA является фермент , разрушающий рецепторы на другом конце вирусного жизненного цикла и расщепляет сиаловой кислоты 2. Все люди , заражающие вирусы, включая H1N1, H2N2 и H3N2, имеют птичьего происхождения 3. На протяжении двух последних десятилетий несколько птиц с человеческими кроссоверов произошли, с вирусом H5N1, H7N7, H7N9 и является наиболее известным; Хаувер, другие подтипы инфицировано более спорадически (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. К счастью, кажется , что ни один из этих вирусов не смогли полностью адаптироваться к человеческого типа α2-6-связанных рецепторов сиаловой кислоты 5-8. Адаптация птиц или других зоонозных вирусов для размещения репликации и передачи в человеческих хостов может оказать разрушительное воздействие на здоровье человека. Поэтому, прежде чем знание того, как эти вирусы эволюционируют связывать рецепторы человеческого типа поможет всемирное наблюдение за появления новых вирусов гриппа.
Определение предпочтений рецепторов впервые была выяснена с использованием эритроцитам различных видов и остается излюбленным среди исследователей анализ гриппа 9-12. Демонстрация того, что вирусы птичьего признают α2-3 сиаловой кислоты и человеческие вирусы α2-6 связанных сиаловой кислоты первоначально была основана на анализе с использованием гемагглютинации эритроцитов ферментативно сконструированных содержат каждый из Linkages 13,14. Хотя считывание гемагглютинации, стандартный тест для вирусологов, лежащие в основе гликановые структуры не определены, только концевую связь. Кроме того, ограниченная доступность из sialyltransferases, используемых для повторной sialylate клетки, ограничивают применение этого анализа 15-18. Впоследствии были введены другие методы определения предпочтений рецептора связывания с использованием сиалилированы гликанов структур , связанных с поли-акриламид (РАА) или поли-глутамата (ПГК) структур в анализах 19,20 плит на основе. Несколько вариантов возможны в покрытии либо гликанов или вирусы на микротитровальных пластин, каждая из которых приводит к получению устойчивой, надежной и очень чувствительного анализа ELISA , типа 21-23. В качестве альтернативы, биотин-связанные гликаны могут заменить PAA / АПГ и могут быть конъюгированы с покрытыми стрептавидином пластинами 2,24. Хотя некоторые специфические сыворотки могут потребоваться, ИФА являются стандартными и несколько гликанов связанных с РАА легко commerciallу и не коммерчески доступны (Консорциум по функциональной Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Glycan технологии микрочипов появились как неоценимый инструмент для определения специфичности рецептора, как и множество различных гликаны замечены, и связывание с широким спектром различных структур может быть оценена в пределах одного анализа 25-29. Связывание IAV к этим структурам обеспечивает лучшее понимание Гликан структур , которые IAV преимущественно распознает 30-33. Glycan микрочипы требуют небольших количеств объема образца для выполнения анализа связывания и использует только незначительное количество гликана на месте (2 NL). Тем не менее, эти массивы, как правило, используются только для оценки специфичности гликанам рецепторов. Анализ нескольких вирусов, или гемагглютинин белки, в нескольких диапазонах концентраций может быть непомерно высокой из-за количества требуемых слайдов. Кроме того, на сегодняшний день, никакого относительного анализа алчность не была разработана с использованием гликана арлучевые методы.
Чтобы объединить требование низкой пробы, обеспечиваемой гликанов методами микрочипов и чувствительности ПАА-связанных гликанов в анализах ELISA на основе, мы стремились разработать многоскважинных гликана массив, который позволил бы проводить анализ с высокой пропускной способностью с аналогичными или более высоким разрешением по сравнению к традиционному ИФА на основе анализа. Одновременно с этим мы хотели бы минимизировать количество биопрепаратов и репортер химических веществ, потребляемых. Конечным результатом является миниатюрной анализа алчность, специально разработанный для мониторинга Iav специфичности и в равной степени применимо для оценки других гликанов связывающих белков. Использование предметного стекла, разделенных на 48 микро-лунки с помощью маски тефлона, 6 различных гликаны замечены в 6 повторах на лунку. Платформа микрочипов дает те же самые тенденции в области связывания с рецептором видели в макроэкономическом формате ELISA с несколькими преимуществами. Они включают в себя (I) печать соединения в 6 повторах, с использованием минимального образца, по сравнению с покрытием из нескольких строк яна пластины, используя 100 мкл на лунку; (II), множество различных соединений анализировали одновременно в одной скважине, в том числе управления; (III) массивное уменьшение объема инкубации и; (IV) больший динамический диапазон с использованием флуоресцентного считывания. Один слайд может быть рассчитана как эквивалент 18x 96-луночные планшеты.
С помощью следующего протокола, любая лаборатория способна фабрикации и анализирующая пятнистый микрочипов должны быть в состоянии изготовить этот миниатюрный формат ELISA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оценка специфичности рецептора Iav является важным шагом в анализе потенциал пандемии птичьего вирусов. Признание сиаловой кислоты с помощью вируса связан с несколькими биологическими свойствами, такими, как связывания и высвобождения из клетки. Знание того, какие аминокислотные мута…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана частично Scripps Microarray Основной фонд, и контракт от Центров по контролю и профилактике заболеваний (JCP). RPdV является получателем гранта Rubicon и Veni от Нидерландской организации научных исследований (NWO). Консорциум по функциональной Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) финансируется за счет гранта NIGMS GM62116 (JCP) представила несколько гликаны, используемых в данном исследовании. Это публикация 29113 из Скриппса научно-исследовательского института.
Materials
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
- Bouvier, N. M., Palese, P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 26, D49-D53 (2008).
- Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
- Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
- Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
- Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
- Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
- Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
- Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6′-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
- Rogers, G. N., D’Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
- Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
- Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
- Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
- Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
- Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
- Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
- Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
- Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
- Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
- Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
- Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
- Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
- Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
- Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
- Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
- de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
- Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
- de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).
