परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ मस्तिष्क polysomes पर peering
Summary
While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
Abstract
Translational मशीनरी, यानी, polysome या polyribosome, कोशिकाओं में सबसे बड़ा और सबसे जटिल cytoplasmic मशीनरी में से एक है। Polysomes, राइबोसोम, mRNAs, कई प्रोटीन और गैर-कोडिंग RNAs द्वारा गठित एकीकृत प्लेटफॉर्म जहां translational नियंत्रण जगह ले प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, जबकि राइबोसोम व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है, polysomes के संगठन अभी भी व्यापक समझ की कमी है। इस प्रकार बहुत प्रयास के क्रम में polysome संगठन और translational नियंत्रण के किसी भी उपन्यास तंत्र है कि एम्बेडेड हो सकता है स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है। परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी का एक प्रकार है कि nanoscale संकल्प पर 3 डी छवियों के अधिग्रहण की अनुमति देता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) तकनीक की तुलना में, AFM के मुख्य लाभ में से एक यह है कि यह दोनों हवा में और समाधान में छवियों के हजारों प्राप्त कर सकते हैं नमूना सक्षम धुंधला हो जाना और समर्थक फिक्सिंग के लिए किसी भी आवश्यकता के बिना पास शारीरिक शर्तों के तहत बनाए रखा जानाcedures। इधर, माउस मस्तिष्क और अभ्रक substrates पर अपने बयान से polysomes की सटीक शुद्धि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल में वर्णित है। इस प्रोटोकॉल AFM और तीन आयामी वस्तुओं के रूप में उनके पुनर्निर्माण के साथ हवा और तरल में polysome इमेजिंग सक्षम बनाता है। क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) के लिए पूरक, प्रस्तावित विधि आसानी से व्यवस्थित polysomes का विश्लेषण करने और उनके संगठन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
प्रोटीन के संश्लेषण कोशिकाओं 1,2 में सबसे अधिक ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया है। इसलिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि प्रोटीन प्रचुरता मुख्य रूप से translational बजाय ट्रांसक्रिप्शनल स्तर 3,4,5 पर नियंत्रित किया जाता है। polysome मौलिक macromolecular घटक है कि कार्यात्मक प्रोटीन readouts में mRNA जानकारी धर्मान्तरित है। Polysomes इस प्रकार अब तक macromolecular परिसर जहां कई translational नियंत्रण एकाग्र 6-13 के रूप में पहचाने जाते हैं। राइबोसोम की संरचना 14- 16 पर अध्ययन के सैकड़ों के बावजूद, अनुवाद की गतिशीलता में विस्तृत आणविक अंतर्दृष्टि और polysomes के टोपोलॉजी एक सीमित ब्याज सामना करना पड़ा है। एक परिणाम के रूप में, देशी polysomal ribonucleoprotein परिसर के संगठन और अनुवाद पर इसके संभावित प्रभाव अभी भी बल्कि अस्पष्ट मुद्दे हैं। Polysomes अभी भी अज्ञात आदेश दिया और कार्यात्मक संगठनों छिपा सकते हैं, संभवतः क्या nucleosomes और epigenetic विवाद mirroringरास प्रतिलेखन क्षेत्र के लिए प्रतिनिधित्व किया है। दरअसल, इस साज़िश परिकल्पना की जांच अतिरिक्त अध्ययन और नई तकनीकी दृष्टिकोण की आवश्यकता है। इस लाइन में, संरचनात्मक तकनीक और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी लाभकारी जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने, वैसे ही क्या nucleosome 17,18 के लिए हासिल किया गया था करने के लिए नए तंत्र को खंडित करने के लिए सहयोग कर सकते हैं।
राइबोसोम 14-16 की खोज के बाद से, इसकी संरचना बड़े पैमाने पर प्रोकैर्योट 19,20, खमीर 21 और मानव 22 में और अधिक हाल ही में बताया गया है, प्रोटीन संश्लेषण के आधार पर तंत्र की आणविक विवरण प्रदान करते हैं। Polysomes शुरू में जालिका की झिल्ली पर मान्यता प्राप्त किया गया है, ठेठ 2 डी ज्यामितीय संगठनों 14 के गठन। जैसा कि पहले उल्लेख किया है, polysome विधानसभा राइबोसोम की संरचना के रूप में निरंतर ब्याज की वस्तु नहीं किया गया है। अतीत में, polysomes टीआर द्वारा अनिवार्य रूप से अध्ययन किया गया हैansmission ईएम आधारित तकनीक। हाल ही में, क्रायो ईएम तकनीक इन विट्रो अनुवाद प्रणालियों 23-26 से शुद्ध polysomes के 3D पुनर्निर्माण, मानव सेलुलर lysates 27 या कोशिकाओं 28 में सक्षम होना चाहिए। इन तकनीकों में polysomes 23, 26-28 और गेहूं के बीज polysomes 24 में आसन्न राइबोसोम के संपर्क सतहों की एक प्रारंभिक आणविक विवरण में राइबोसोम-राइबोसोम संगठन के बारे में और अधिक परिष्कृत जानकारी की पेशकश की। इस प्रकार, क्रायो ईएम टोमोग्राफी आणविक विस्तार के साथ राइबोसोम-राइबोसोम बातचीत का खुलासा करने की अनुमति देता है, लेकिन यह व्यापक बाद के प्रसंस्करण के बोझ से दबे है और पुनर्निर्माण का विश्लेषण करती डेटा से निपटने के लिए भारी कम्प्यूटेशनल संसाधनों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, राइबोसोम-राइबोसोम बातचीत की आणविक विस्तार प्राप्त करने के लिए, राइबोसोम की एक उच्च संकल्प लिया नक्शा आवश्यक है, और संदर्भ राइबोसोम के इस तरह के केवल कुछ प्रजातियों के लिए उपलब्ध है। महत्वपूर्ण बात है, क्रायो ईएम टोमोग्राफी मुक्त आरएनए का पता लगाने में सक्षम नहीं है। Therefअयस्क, नई तकनीक पूरी तरह से अनुवाद मशीनरी के संगठन को समझने के लिए आवश्यक हैं।
बगल में क्रायो ईएम, AFM भी कम eukaryotes 29-33 और मनुष्यों के 27 में polysomes के प्रत्यक्ष इमेजिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में नियोजित किया गया है। ईएम की तुलना में, AFM कोई नमूना निर्धारण या लेबलिंग की आवश्यकता है। इसके अलावा, माप के पास शारीरिक स्थितियों में और स्पष्ट रूप से दोनों राइबोसोम और नग्न आरएनए किस्में 27 की पहचान करने की अनूठी संभावना के साथ किया जा सकता है। एकल polysomes की इमेजिंग अपेक्षाकृत जल्दी व्यापक और भारी बाद के प्रसंस्करण के लिए और पुनर्निर्माण क्रायो ईएम माइक्रोस्कोपी द्वारा आवश्यक विश्लेषण तुलना में थोड़ा बाद के प्रसंस्करण के प्रयास के साथ नैनो संकल्प पर छवियों के हजारों प्राप्त किया जा सकता है। नतीजतन, AFM डेटा को संभालने और विश्लेषण महंगा कार्यस्थानों और उच्च कंप्यूटिंग शक्ति की जरूरत नहीं है। जैसे, इस तकनीक के लक्षण polysomal आकार के बारे में जानकारी, (जैसे एकत्रऊंचाई, लंबाई और चौड़ाई), राइबोसोम घनत्व, मुक्त शाही सेना की मौजूदगी और क्रायो ईएम तुलना में एक उच्च throughput के साथ polysome 27 प्रति राइबोसोम की संख्या। इस तरह से, AFM ईएम तकनीकों के लिए एक शक्तिशाली और पूरक दृष्टिकोण polysomes 27 चित्रित करने का प्रतिनिधित्व करता है।
यहाँ हम शुद्धि से डेटा विश्लेषण जहां AFM छवि के लिए आवेदन किया है और माउस मस्तिष्क polysomes का विश्लेषण किया जाता है के लिए एक पूर्ण पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तावित प्रोटोकॉल शुद्धि के मुद्दों पर और अभ्रक substrates पर polysomes कि AFM इमेजिंग के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं की सटीक बयान पर केंद्रित है। पारंपरिक कण विश्लेषण है कि आसानी से आम AFM समुदाय द्वारा इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है के अलावा, एक ImageJ 34 प्लगइन, RiboPick कहा जाता है, polysome 27, 35 प्रति राइबोसोम की संख्या की गणना के लिए प्रस्तुत किया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
के रूप में डीएनए की संरचना की प्रतिलेखन और क्रोमेटिन के संगठन जीन अभिव्यक्ति के transcriptional नियंत्रण के बारे में हमारी समझ के रूप में उन्नत प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण साबित हो गय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Materials
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
References
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).
- Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
- Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145 (3), 383-397 (2011).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).
- Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).
- van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).
- Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).
- Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).
- McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).
- Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2 (197), 430-435 (1963).
- Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).
- Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289 (5481), 905-920 (2000).
- Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102 (5), 615-623 (2000).
- Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).
- Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).
- Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
- Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).
- Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).
- Brandt, F., Carlson, L. -. A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
- Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).
- Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).
- Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
- Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
- Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
- Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
- Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).
