Peering på Brain polysomer med atomkraftsmikroskopi
Summary
While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
Abstract
Translations maskiner, dvs polysom eller polyribosome, är en av de största och mest komplexa cytoplasmiska maskinerier i celler. Polysomer, som bildas av ribosomer, mRNA, flera proteiner och icke-kodande RNA, representerar integrerade plattformar där translationella kontroller sker. Men medan ribosomen har studerats ingående, anordnande av polysomer saknas fortfarande omfattande förståelse. mycket arbete krävs således för att belysa polysom organisation och någon ny mekanism för translationell kontroll som kan bäddas in. Atomkraftsmikroskopi (AFM) är en typ av svepspetsmikroskopi som gör förvärvet av 3D-bilder i nanoskala upplösning. Jämfört med elektronmikroskopi (EM) tekniker, är en av de främsta fördelarna med AFM att det kan få tusentals bilder både i luft och i lösning, vilket gör att provet som skall hållas under nära fysiologiska förhållanden utan behov av färgning och fastställande proförfaranden. Här är ett detaljerat protokoll för noggrann rening av polysomer från mushjärna och deras avsättning på glimmersubstrat beskrivs. Detta protokoll möjliggör polysom avbildning i luft och vätska med AFM och deras rekonstruktion som tredimensionella objekt. Som komplement till Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), kan den föreslagna metoden lämpligen användas för att systematiskt analysera polysomer och studera deras organisation.
Introduction
Syntesen av protein är det mest energikrävande process i celler 1,2. Därför är det inte förvånande att protein abundances styrs främst på translationell snarare än transkriptionsnivå 3,4,5. Den polysom är den fundamentala makromolekylära komponent som omvandlar mRNA informationen till funktionella protein avläsning. Polysomer är hittills erkänts som makromolekylära komplex där flera translationella kontroller konvergerar 6-13. Trots hundratals studier på ribosomen struktur 14- 16, har de detaljerade molekylära insikter dynamiken i översättning och topologi polysomer stött på ett begränsat intresse. Som en följd av organisationen av den infödda polysomal ribonukleoprotein komplex och dess potentiella inverkan på översättning är fortfarande ganska dunkla frågor. Polysomer kan dölja fortfarande okända beställt och funktionella organisationer, potentiellt spegling vad nukleosomer och epigenetiska controls har representerat för transkriptionen fältet. Faktum är att undersökningen av denna spännande hypotes kräver ytterligare studier och nya tekniska metoder. I denna linje, kan strukturella tekniker och atomkraftsmikroskopi fruktbart samarbeta för att riva upp nya mekanismer för att kontrollera genuttryck, i likhet med det som uppnåddes för nukleosomen 17,18.
Sedan upptäckten av ribosomen 14-16, har dess struktur i stor utsträckning präglas i prokaryoter 19,20, jäst 21 och mer nyligen i mänsklig 22, vilket ger molekylär beskrivning av mekanismerna vid basen av proteinsyntes. Polysomer var initialt på membranet i det endoplasmatiska nätverket och bildar typiska 2D geometriska organisationer 14. Som tidigare nämnts har polysom monteringen inte varit föremål för konstant intresse som ribosomen struktur. I det förflutna, har polysomer studerats i huvudsak av transmission EM-baserade tekniker. Först nyligen, Cryo-EM teknik gjort det möjligt för 3D-rekonstruktion av renade polysomer från in vitro translationssystem 23-26, mänskliga cellulära lysat 27 eller i cellerna 28. Dessa tekniker erbjuds mer raffinerad information om ribosomen-ribosomen organisation i polysomer 23, 26-28 och en preliminär molekylär beskrivning av kontaktytorna på intilliggande ribosomer i vetegroddar polysomer 24. Således kan Cryo-EM tomografi utlämnandet av ribosomen-ribosomen interaktion med molekylär detalj, men det belastas av omfattande efterbearbetning och återuppbyggnad analyser som kräver tunga beräkningsresurser för datahanteringen. Dessutom, för att erhålla molekyl detalj av ribosomen-ribosomen interaktion, är en mycket löst karta av ribosomen som krävs, och denna typ av referens ribosomen är endast tillgänglig för ett fåtal arter. Viktigt är Cryo-EM tomografi inte kunna upptäcka fri RNA. Therefmalm, är nya tekniker som krävs för att till fullo förstå organisationen av översättnings maskiner.
Bredvid Cryo-EM, har AFM varit också som ett användbart verktyg för direkt avbildning av polysomer i lägre eukaryoter 29-33 och människor 27. Jämfört med EM kräver AFM inget prov fixering eller märkning. Dessutom kan mätningar utföras i nära fysiologiska förhållanden och med den unika möjligheten att tydligt identifiera både ribosomer och nakna RNA-strängar 27. Avbildning av enstaka polysomer kan utföras relativt snabbt, få tusentals bilder på nano upplösning med lite efterbearbetning ansträngning jämfört med den omfattande och tung efterbearbetning och rekonstruktion analyser som krävs av Cryo-EM mikroskopi. Följaktligen AFM hantering och analys av data inte behöver dyra arbetsstationer och hög datorkraft. Som sådan, samlar denna teknik information om polysomal former, morfologiska egenskaper (såsomhöjd, längd och bredd), ribosom-densiteter, närvaro av fritt RNA och antalet ribosomer per polysom 27 med en högre genomströmning än Cryo-EM. På ett sådant sätt, AFM utgör ett kraftfullt och komplement till EM tekniker för att framställa polysomer 27.
Här presenterar vi en komplett pipeline från rening till dataanalys där AFM tillämpas på bilden och analysera mus hjärnan polysomer. Det föreslagna protokollet fokuserar på reningsfrågor och korrekt avsättning av polysomer på glimmer substrat som används för AFM avbildning. Förutom konventionell partikelanalys som lätt kan genomföras med gemensam programvara som används av AFM gemenskap, en ImageJ 34 plugin, kallad RiboPick, presenteras för att räkna antalet ribosomer per polysom 27, 35.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom strukturen av DNA visat sig vara av avgörande betydelse för att beskriva processen av transkription och som organisationen av kromatin avancerade vår förståelse av transkriptionskontroll av genuttryck, är det viktigt att analysera organisation och struktur polysomer att förbättra sanningsenlig förståelse översättning och dess reglering.
Med det beskrivna protokollet, en optimal täthet av polysomer försiktigt immobiliserade på en plan yta, lämplig för AFM avbildning …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Materials
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
References
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).
- Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
- Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145 (3), 383-397 (2011).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).
- Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).
- van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).
- Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).
- Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).
- McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).
- Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2 (197), 430-435 (1963).
- Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).
- Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289 (5481), 905-920 (2000).
- Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102 (5), 615-623 (2000).
- Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).
- Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).
- Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
- Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).
- Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).
- Brandt, F., Carlson, L. -. A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
- Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).
- Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).
- Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
- Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
- Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
- Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
- Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).
