Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
एक उपन्यास विच्छेदन और रिकॉर्डिंग तकनीक ऑप्टिकल निगरानी धुंधला और भाले के आकार माउस पंख की त्वचा में बालों के रोम के आसपास के टर्मिनलों के डी-धुंधला के लिए वर्णित है। तैयारी मज़बूती से तंत्रिका टर्मिनलों रहने वाले तेज और styryl pyridinium रंगों बड़े पैमाने पर पुटिका रीसाइक्लिंग के अध्ययन में इस्तेमाल की रिहाई का अध्ययन करने के कई लेबल इकाइयों के व्यापक क्षेत्रों उपज, सरल और अपेक्षाकृत तेज है। लेबलिंग से पहले तैयारी के उप-विभाजित परीक्षण बनाम एक ही व्यक्ति से एक ही कान में नियंत्रण तुलना की अनुमति देता है। उपयोगी सुझाव तैयार करने, लेबलिंग और इमेजिंग मापदंडों की गुणवत्ता में सुधार लाने के लिए दिया जाता है। इस नई प्रणाली औषधीय परख करने की क्रिया और यंत्रवत् प्रेरित तेज और दोनों प्रकार के जंगली में भाले के आकार टर्मिनलों में इन महत्वपूर्ण रंगों और आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों की रिहाई के लिए उपयुक्त है। लेबलिंग तीव्रता पर modulatory प्रभावों के उदाहरण दिए गए हैं।
Mechanosensory तंत्रिका अंत, बगल में उपयोग करने के लिए आम तौर पर, छोटे diffusely वितरित और मुश्किल हो जाता है के रूप में वे आम तौर पर त्वचा या अन्य आसपास के ऊतकों में गहरे दफन कर रहे हैं। उन्हें visualizing, इसलिए, आम तौर पर एक लंबे समय तक immunolabeling / धुंधला अवधि, या देरी और खर्च के इस तरह के हरे या पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP / YFP) 1 के रूप में फ्लोरोसेंट लेबल के आनुवंशिक अभिव्यक्ति के साथ माउस लाइनों प्राप्त करने के द्वारा पीछा किया सेक्शनिंग की आवश्यकता है। यहाँ हम एक सुविधाजनक ऊतक और एक त्वरित और आसान विधि अध्ययन के लिए बाल कूप afferents की बड़ी संख्या के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए दिखाने के लिए, और वे जल्दी से टर्मिनल 2 समारोह के ऑप्टिकल निगरानी के लिए लेबल किया जा सकता है कि कैसे। अभ्यास के साथ, इमेजिंग के लिए विच्छेदन से पूरे तकनीक के रूप में छोटे रूप में 2 घंटे में पूरा किया जा सकता।
संवेदी axons की भाले के आकार टर्मिनलों innervating स्तनधारियों में बालों के रोम-बाल कूप के आसपास उपकला Palisades फार्म, प्रत्येक के साथglial / श्वान सेल के बीच sandwiched टर्मिनल 2-4 प्रक्रियाओं। टर्मिनलों के उद्देश्य बाल वे चारों ओर के यांत्रिक विस्थापन का पता लगाने के लिए है। वे तेजी से और धीरे धीरे आदत डाल अंत का एक मिश्रण हैं, लेकिन वे मुख्य रूप से बालों के आंदोलन के जवाब में गतिविधि की कमी फटने का उत्पादन। आमतौर पर, फायरिंग, बहुत जल्दी जब आंदोलन रहता है बंद हो जाता है भी जारी रखा विस्थापन की उपस्थिति में।
ऑप्टिकल तरीकों से भाले के आकार टर्मिनलों के अध्ययन के लिए यह murine पंख मॉडल संरचना और इन अंत के समारोह के अध्ययन के लिए कई लाभप्रद विशेषताएं है। पंख मुख्य रूप से त्वचा की दो परतों के बैक-टू-बैक केवल बीच उपास्थि ऊतक के एक छोटी राशि के साथ apposed है। त्वचा शरीर के अन्य क्षेत्रों के लिए कमजोर चिपकने वाला संयोजी ऊतक रिश्तेदार की न्यूनतम मात्रा के कारण बहुत पतली और आसानी से विच्छेदित है। आसानी से अलग त्वचा की परतों, इसलिए, रोम और टर्मिनलों के लिए अच्छा उपयोग दे। इन्नेर्वतिओनआसानी से सुलभ और पहचाने जाने योग्य है। बालों के रोम और अधिक कम अन्य त्वचा क्षेत्रों की तुलना में वितरित कर रहे हैं, रोम के व्यक्तिगत या छोटे समूहों की इमेजिंग की सुविधा। पतली अंतर्निहित त्वचीय परत रंगों और औषधीय दवाओं के लिए अच्छी पहुंच देता है, तो आगे की प्रक्रिया के बिना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए आदर्श है। अगर एक फिक्स डाई एनालॉग का उपयोग कर, निर्धारण और आगे ऊतकीय प्रसंस्करण के बाद लेबल टर्मिनलों की इमेजिंग रहने वाले टर्मिनलों के लिए या तो हो सकता है या कर सकते हैं।
हम इस तैयारी का इस्तेमाल किया है कि झिल्ली रीसाइक्लिंग भाले के आकार अंत में होता है, तेज (endocytosis) और एक styryl pyridinium डाई (FM1-43 की रिहाई (exocytosis) इसका सबूत दिखाने के लिए, एन – (3-triethylammoniumpropyl) -4 (4 (dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromide)। डाई नहीं है, तथापि, काफी लेबल करने के लिए निवेश श्वान सेल प्रक्रियाओं 2 प्रतीत होता है। हम यह भी है कि इस डाई तेज / रिलीज से पता चला है, और इसलिए आर झिल्लीeCycling, एक असामान्य (phospholipase डी-युग्मित) metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर के माध्यम से ग्लूटामेटरगिक मॉडुलन के अधीन है। सरल उत्तेजना और विश्लेषण प्रोटोकॉल के परिणामों सचित्र हैं, और आम संभावित विश्लेषण मुद्दों पर भी डाला जाता है।
Bewick और Betz मूल एन (3-triethylammoniumpropyl) -4 (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromide से संबंधित styryl pyridinium रंगों 7-10 synaptic पुटिका झिल्ली की स्थानीय रीसाइक्लिंग की निगरानी के लिए विकसित की है। डाई तेज, और इसलिए वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति, इसलिए synaptic पुटिका झिल्ली internalization (endocytosis) को दर्शाता है। बाद में, इस भाँति डाई आगे बिजली की गतिविधि द्वारा फिर से जारी किया जा सकता है, डाई नुकसान दिखा पुटिका झिल्ली externalization (exocytosis) नजर रखता है। synapses में, इस न्यूरोट्रांसमीटर स्राव के लिए एक प्रॉक्सी है। एक ही समय में, हम यह भी पाया गया है इन रंगों प्राथमिक mechanosensory तंत्रिका अंत 7 लेबल। अभी हाल ही में 11, Bewick, बैंकों और उनके सहयोगियों तो पता चला कि यह परिपक्व, विभेदित mechanosensory टर्मिनलों पूर्व vivo में एक इसी तरह की प्रक्रिया को दर्शाता है। यहाँ फिर से, रंगों 50 एनएम व्यास 'synaptic की तरह' पुटिकाओं (SLVs) कि अनिवार्यता से रीसायकल ग्लूटामेट जारी करने के लिए लेबल।mechanosensory टर्मिनलों में, उनके synaptic समकक्षों के विपरीत, इस रीसाइक्लिंग मुख्य रूप से सहज है। यह भी यांत्रिक, के बजाय सिर्फ बिजली, उत्तेजना से ठीक किया जाता है।
संस्कृति और कोक्लीअ बालों की कोशिकाओं, सामान्य और विशेष रूप styryl pyridinium डाई में styryl रंगों में संवेदी न्यूरॉन्स के लिए mechanosensory चैनलों के माध्यम से पारित करने के लिए दिखाया गया है, mechanosensory चैनलों अवरुद्ध और अचल आंतरिक झिल्ली 12 लेबलिंग। हालांकि, मांसपेशियों स्पिंडल 11 में बगल में विभेदित mechanosensory टर्मिनलों, यहाँ के रूप में तुलनीय styryl डाई सांद्रता भाले के आकार अंत 2, या आइए अंत में, पर और बालों की कोशिकाओं है कि यंत्रवत् प्रेरित नहीं कर रहे हैं 13, 14 में, लेबलिंग झिल्ली endocytosis के द्वारा होता है। Mechanosensory तंत्रिका टर्मिनलों में, उदाहरण के लिए, लेबलिंग प्रतिवर्ती है और यहां इस्तेमाल किया 2, 11, 1 सांद्रता में mechanosensory प्रतिक्रियाओं ब्लॉक नहीं करता5। जबकि इन अंत में चैनल पारगमन द्वारा कुछ डाई internalization पूरी तरह से इंकार नहीं किया जा सकता है, latrotoxin साथ पास कुल destain इंगित करता है परिपक्व टर्मिनलों में लेबलिंग के महान बहुमत रीसाइक्लिंग पुटिका झिल्ली के साथ internalization के द्वारा होता है। इसलिए हमने, इस तकनीक गतिविधि निर्भरता 11 अध्ययन करने के लिए, mechanosensory अभिवाही टर्मिनलों में एसएलवी रीसाइक्लिंग के औषध विज्ञान 2 तेज और रंगों की रिहाई पर दवा के प्रभाव का परीक्षण करके इस्तेमाल किया और, सबसे हाल ही में।
सबसे व्यावहारिक तकनीकों के साथ के रूप में, reproducibility पुनरावृत्ति और अभ्यास की आवश्यकता है। विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण बिंदुओं में से कुछ अब चर्चा की जाएगी। छोटे जानवरों में भाले के आकार लेबलिंग और अधिक विश्वसनीय है – छोटी जानवर हम इस्तेमाल किया है 15 ग्राम शरीर के वजन था। यह पूरी तरह स्पष्ट है कि क्यों यह मामला है नहीं है, लेकिन यह हो सकता है क्योंकि युवा संयोजी ऊतक के विच्छेदन कम यांत्रिक आघात और le की आवश्यकता हैएविस कम अवशेषों शेष जब ऊतकों इन्नेर्वतिओन परत को हटाने overlying।
कुल मिलाकर, ऊतक तैयारी केवल बड़े चूहों में अलग त्वचा की परतों छीलने जा रहा है सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण व्यावहारिक पहलू और फिर साथ काफी सरल है। इन में, त्वचा की परतों के आधार पर दृढ़ता से एक साथ पालन जहां विच्छेदन शुरू होता है, लेकिन यहां भी परतों की जुदाई मार्जिन के प्रति ज्यादा आसान हो जाता है। शुक्र है, या शायद नतीजतन, इन पतले सीमांत क्षेत्रों में आमतौर पर त्वचा सबसे संतोषजनक लेबलिंग, के रूप में आम तौर पर पूर्वकाल त्वचा करता दे। इसलिए, विशेष रूप से हाशिये पर बहुत पतली त्वचा लोभी से बचें। नुकसान के जोखिम को कम करने के बजाय बंद संदंश के साथ धक्का सीधे लोभी द्वारा परोक्ष रूप से तैयारियों में हेरफेर, या आवश्यक समझ ही मुश्किल संभावना नहीं ऊतकों लेबल किया जा रहा है। 'चादर polystyrene' परत को हटाने के तुरंत के रोम overlying में पूरी तरह से, यह मुख्य रूप से मुझे हैइमेजिंग और नशीली दवाओं का उपयोग करने के लिए chanical बाधा। हालांकि, यह और बस के नीचे इस नुकसान के रूप में आधारभूत संरचनाएं (यानी, दूर स्ट्रिप्स) तंत्रिका नेटवर्क टर्मिनलों के साथ शारीरिक संपर्क को कम करने के लिए आवश्यक है। अगर प्रमुख प्रतिदीप्ति पीला / वसामय ग्रंथियों में सफेद है, बाल शाफ्ट कुर्सियां और नारंगी / पीले भाले के आकार अंत के कुछ crescents की प्रमुख ऑटो प्रतिदीप्ति, यह तंत्रिका जाल परत और संबद्ध भाले के आकार टर्मिनलों निकासी के दौरान हटा दिया गया है इंगित करता है। यह पुराने (> 30 ग्राम) चूहों के साथ मुख्य समस्या प्रतीत होता है। धुंधला प्रक्रियाओं के दौरान, यह सुनिश्चित सब कुछ 30 डिग्री सेल्सियस पर है और अच्छी तरह से ऑक्सीजन। पता है कि लेबल टर्मिनलों अभी भी जीवित हैं बनें। नतीजतन, डाई चल रही सहज (विधान) exocytic रिहाई के द्वारा स्रावित कर दिया जाएगा। यह आर / टी पर धीमी हो जाएगी, लेकिन यह डाई नुकसान को कम करने, chelator समाधान और इमेजिंग के हटाने के बीच देरी को कम करने के लिए अच्छा अभ्यास है। इसके अलावा, के लिए बीच-समूहों तुलनात्मक रोंतीव्रता के tudies, यह सभी समूहों की इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए जरूरी है समय से मिलान है। इमेजिंग से पहले एक डाई-chelating एजेंट का उपयोग बहुत छवि के विपरीत सुधार। तो, जबकि अपेक्षाकृत महंगा है, केलेशन कदम अच्छी छवि गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए काफी महत्वपूर्ण है। Chelator उपयोग समाधान के लिए कई बार पुन: उपयोग करके कम से कम किया जा सकता है, और यहां तक पर 2 – 3 लगातार दिन, अगर उपयोगों के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। chelator समाधान त्यागें एक बार यह काफ़ी गुलाबी हो जाता है, इसकी डाई ज़ब्ती संतृप्ति आ रहा है दिखा।
इमेजिंग के दौरान, इन रहने वाले टर्मिनलों के लिए phototoxic क्षति है, जो दोनों तीव्रता और उत्तेजना प्रकाश का जोखिम समय की संचयी परिणाम है के लिए क्षमता के बारे में पता हो। यह विचार ही timepoint छवियों, जहां छवि गुणवत्ता प्राथमिक चिंता का विषय है के लिए कम महत्वपूर्ण है। हालांकि, यह एक न्यूनतम करने के लिए उत्तेजना प्रकाश जोखिम को कम करने के कैनेटीक्स अध्ययन में दोहराया इमेजिंग के दौरान महत्वपूर्ण है। जबकि करने के लिए इन रंगों के विकासलेबल synapses, हम पूरी शक्ति उत्तेजना रोशनी में> 1 मिनट तंत्रिका टर्मिनलों के लिए नाटकीय और अपूरणीय क्षति होगी लिए उत्तेजना पाया। वे पहली बार बाद में बेहद विस्तार, फिर ~ से 15 मिनट की अवधि में पूरी तरह से पतन। हम व्यवस्थित जोखिम समय और तीव्रता के रिश्तेदार योगदान परीक्षण नहीं किया है, लेकिन इन टिप्पणियों का सुझाव मार्गदर्शक सिद्धांत दोनों को कम से कम करने के लिए किया जाना चाहिए। इसलिए, यह सिफारिश की है कि उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता और अवधि कम से कम अच्छा छवियों के साथ हो रही अनुरूप हैं, और उचित नियंत्रण छवियों समय पाठ्यक्रम के अध्ययन में लिया जाता है। जांचने के लिए कि डेटा दोहराया इमेजिंग शर्तों के तहत phototoxicity से प्रभावित नहीं हैं हर समय बिंदु पर, एक पहले से unviewed टर्मिनल के एक अतिरिक्त छवि ले। यह सुनिश्चित करने के लिए अनुभवहीन टर्मिनलों में लेबलिंग के व्यवहार जैसा दिखता है कि रोम में बार बार imaged किया जा रहा है।
कारकों की एक संख्या शुद्ध तीव्रता डी के भीतर-समूह परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैंअता। रूप में चिह्नित करें धुंधला की भी छोटे क्षेत्रों में काफी बीच-कूप डेटा परिवर्तनशीलता को प्रभावित कर सकते ROIs के सटीक स्थान में, विशेष रूप पृष्ठभूमि रॉय, महत्वपूर्ण है। शुद्ध तीव्रता की परिवर्तनशीलता भी कैसे पूरी तरह से एक बाल कूप अंत के कटघरा से घेर लिया है से प्रभावित है। उदाहरण के लिए की तुलना करें, लगभग पूरी तरह से परिपत्र पैटर्न चित्रा 2 में देखा के साथ चित्रा 1 बी में अर्द्ध चंद्राकार आकार लेबलिंग वितरण। अधिक जटिल विश्लेषण, शायद स्वचालित सॉफ्टवेयर का पता लगाने और thresholding का उपयोग कर, आवश्यक हैं यदि घेरा की डिग्री एक प्रासंगिक पैरामीटर है। कृपया ध्यान दें कि यहां तक कि सबसे सही विश्लेषण किया कूप समूहों के लिए तीव्रता वितरण सामान्य रूप से वितरित नहीं किया है (चित्रा 3 देखें), बीच-उपचार का मतलब आबादी medians के बजाय की तुलना के लिए गैर पैरामीट्रिक आँकड़ों के उपयोग की जरूरत महसूस। इस तरह के एक प्रतिशत के रूप में ओ तीव्रता व्यक्त के रूप में सामान्य बनाने की तकनीक,एफ contralateral नियंत्रण, या एक नियंत्रण समूह के कई तैयारियों के ऊपर, आगे परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए लागू किया जा सकता बना दिया। अंतिम तकनीकी आइटम पर विचार किया जाएगा औषधीय परीक्षण के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन है। औषधीय जांच के दौरान डाई आवेदन से पहले 30 मिनट के लिए दवा के घोल में तैयारी पूर्व सेते हैं। फिर, डाई समाधान में दवा एकाग्रता बनाए रखें। नियंत्रण में, या तो खारा का उपयोग करें या, अगर दवा एक वाहन, खारा प्लस वाहन में भंग कर रहा है।
वर्तमान लेख दर्शाता है कि कैसे इस नए पंख तैयारी न्यूनतम तैयारी के साथ त्वचा में mechanosensory अंत की उच्च गुणवत्ता के चित्र प्रदान करता है। हम भी यह पुटिका रीसाइक्लिंग के दो महत्वपूर्ण पहलुओं में से औषध विज्ञान की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दिखा। हम पहले बताते हैं कि एक ग्लूटामेट रिसेप्टर agonist डाई internalization (endocytosis के एक मार्कर) में वृद्धि कर सकते हैं, और दूसरा, कि डाई latrotoxin (exocytosis की एक उत्तेजक) के साथ फिर से खो दिया है। इस preparat का महत्वआयन और तकनीक है कि यह इमेजिंग प्रयोगों के लिए बगल में त्वचा mechanosenory टर्मिनलों रहने वाले, टर्मिनल समारोह, संरचना और उनके अंतर-संबंधों के ऑप्टिकल निगरानी के लिए अद्वितीय अवसर affording के लिए उत्कृष्ट पहुँच प्रदान करता है। इस बाद अंत करने के लिए, हम भी इसे आगे संयुक्त ऑप्टिकल / electrophysiological अध्ययन (विवरण के लिए बहन जौव लेख) में उपयोग के लिए विकसित किया है।
The authors have nothing to disclose.
काम जीएसबी के लिए ब्रिटेन चिकित्सा अनुसंधान परिषद परियोजना अनुदान G0601253 और RWB और जीएसबी के लिए एक SULSA Bioskape अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया
PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |