Gene Transfer til kylling Auditory Organ med<em> I Ovo</em> Micro-elektroporation

Summary

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Abstract

Kylling embryoner er ideelle modelsystemer til at studere embryonale udvikling som manipulationer af gen-funktion kan udføres med relativ lethed i ovo. Det indre øre auditive sanseorgan er afgørende for vores evne til at høre. Det huser en højt specialiseret sensoriske epithel, der består af mekanisk-transducerende hårceller (HC) og omgivende glia-lignende understøttende celler (SCS). Trods strukturelle forskelle i de auditive organer, er molekylære mekanismer, der regulerer udviklingen af den auditive organ evolutionært bevaret mellem pattedyr og aves in ovo elektroporering er stort set begrænset til tidlige stadier på E1 -. E3. På grund af den relative sene udvikling af den auditive organ på E5, manipulationer af den auditive orgel ved in ovo elektroporering forbi E3 er vanskelig på grund af den avancerede udvikling af kylling embryo på senere stadier. Fremgangsmåden præsenteres her er en forbigående genoverførselsfremgangsmåde til målretning gener af interesse påfase E4 – E4.5 i udviklingslandene kylling auditive sanseorgan via in ovo mikro-elektroporation. Denne metode anvendes til GAIN- og tab af funktioner og konventionelt plasmid DNA-baserede ekspressionsvektorer og kan kombineres med in ovo celleproliferationsassay ved tilsætning edu (5-ethynyl-2'-deoxyuridin), til hele embryo på tid af elektroporering. Anvendelsen af ​​grønt eller rødt fluorescerende protein (GFP eller RFP) ekspressionsplasmider tillader eksperimentatoren hurtigt afgøre, om elektroporering lykkedes at målrette auditive del af den udviklende indre øre. I denne fremgangsmåde papir, er repræsentative eksempler på GFP elektroporeret enheder illustreret; embryoer blev høstet 18 – 96 timer efter elektroporering og målretning af GFP til den pro-sensoriske område for den auditive orgel blev bekræftet ved RNA in situ hybridisering. Fremgangsmåden papir tilvejebringer også en optimeret protokol til anvendelsen af ​​thymidin analog edu at analysere celle spredningsrelateredebejde; et eksempel på en edu baseret celleproliferationsassay, der kombinerer immuno-mærkning og klik edu kemi er tilvejebragt.

Introduction

Trods forskelle i morfologi og cellulære mønster mellem pattedyr og fugle auditive sanseorgan, er de molekylære faktorer og veje, der er ansvarlige for sensorisk HC udvikling menes at være evolutionært bevaret ^1-3. Basilar papilla, som huser de auditive HCS og deres omkringliggende SCs, udvikler sig som en outpocketing i det indre øre otocyst. Tidligt på en pulje af HC og SC stamfædre er angivet i den otiske placode / otiske kop neural-sensorisk kompetent domæne (NSD). Fate-kortlægning data giver belæg for, at neuronale og sensoriske slægter er forbundet og opstå fra NSD placeret i antero-ventrale region af otiske kop eller otocyst i mus og kylling ^4,5. Først neuroblaster delaminere fra NSD at give anledning til neuronerne i den auditive-vestibulære ganglion, som i sidste ende opdelt i auditiv og vestibulær ganglier. Disse neuroner innerverer de sensoriske HC'er i det indre øre og kerner i hjernestammen. Cellerne thved forblive i NSD menes at give anledning til forskellige sensoriske patches, herunder den auditive sanseorgan bestående af de mekanisk-transducerende sensoriske HCS og deres tilknyttede SC'er.

I både chick og murine, høreorgan sensorisk progenitorcelle-cyklus exit og HC differentiering forekommer i modsatte hældninger. I chick, begynder auditive stamcelle-cyklus exit omkring ~ E5 og skrider fra bunden til toppen, og fra midten til periferien ^6. En dag senere, HC differentiering starter i spidsen og udvikler sig til bunden ^7. Undersøge udviklingen af det indre øre i kylling giver mange tekniske fordele som funktionelle mekanismer kan undersøges med relativ lethed in ovo i modsætning til at manipulere embryoner in utero i andre modelsystemer, som kræver komplekse operationer. Den her beskrevne metode bruger i ovo mikro-elektroporation til at målrette gener af interesse i den formodede Basilar papilla område anterior-ventralt i otisk vesikel specifikt mod E4.

Elektroporering in ovo er en teknik, er veletableret og almindeligt anvendte ^8-14. Princippet i elektroporationsteknik er baseret på den kendsgerning, at nukleotider (fx plasmid-DNA, syntetisk DNA eller RNA oligonukleotider) er negativt ladede. DNA'et injiceres i vævet af interesse. Når en elektrisk strøm sættes på tværs af væv, den nuværende åbner transiente porer i cellevæggene og muliggør optagelse af DNA, som det negativt ladede DNA flyder mod den positive elektrode (anoden). For gevinst-of-function eksperimenter, er gener af interesse almindeligvis subklonet i ekspressionsplasmider, der indeholder passende ekspressionskassetter for grønt fluorescerende protein (GFP) eller rødt fluorescerende protein (RFP). For tab-af-funktion eksperimenter plasmid-baserede dominerende negative repressor konstruktioner eller RNAi eller morpholino konstruktioner er commonly brugt ^15,16. Til hæmning microRNA (miRNA) -funktionen miRNA svamp konstruktioner, som typisk plasmid baseret, kan anvendes ^17. Den her beskrevne fremgangsmåde giver mulighed for at undersøge de molekylære mekanismer, der styrer proliferation og differentiering i den auditive organ, som den in ovo mikro-elektroporeringsmetoden kan let kombineres med in ovo celleproliferationsassay ved tilsætning edu til hele embryo.

Den elektroporering og tilsætning af edu udføres ved E4 i otisk vesikel, der er én dag før indtræden af ​​cellecyklus-exit i den auditive orgel. Analyse af den auditive organ er typisk 18 – 96 timer efter elektroporering ved E5 (indtræden af ​​sensorisk progenitorcelle-cycle exit), E6 (indtræden af ​​HC differentiering), og E7 (i HC differentiering); og senere op til ~ E9 (slutningen af ​​HC differentiering). Denne elektroporering fremgangsmåde til genoverførsel er forbigående varig ca. ~ 4 dage, becauSE generne af interesse ikke integreres i genomet, men metoden er anvendelig til brug med passende plasmid DNA-baserede ekspressionsvektorer, som har evnen til at integrere i genomet, såsom Tol2 genoverførsel ^11. Med denne metode robust GFP eller RFP udtryk varer ~ 4 dage i cochlea, hvorefter peger signalerne fade, men giver en rigelig tid vindue til at studere den indviklede udvikling af det auditive orgel. Dette in ovo genoverførselsfremgangsmåde er ny og giver mulighed for specifikt at målrette den formodede auditive orgel ved E4, som er optimal for undersøgelser, der fokuserer på HC udvikling i det auditive orgel. Det er en god tilføjelse til alternative metoder, der elektroporere på langt yngre udviklingsstadier ^11,12 eller i forhold til brugen af in vitro basilar papiller eksplantatkulturer ^18.

Protocol

Æggene og uklækkede embryoner bliver passet og behandlet etisk og humant. Alle protokoller for uklækkede embryo brug blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg på Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland. 1. Æg og Udarbejdelse af ekspressionskonstruktioner Æg: Der inkuberes 3 – 4 dusin befrugtede hønseæg (Gallus gallus), der ligger fladt på deres sider ved 37 ° C. Efter 24 timers inkubation, træk 3 cc af æggehvi…

Representative Results

I denne fremgangsmåde papir plasmid DNA bestående af grønt fluorescerende protein (GFP) ekspressionskassetter blev målrettet til at udvikle kylling basilar papilla (BP) med optimerede parametre for 12 V og 4 impulser med 100 ms pulsvarighed og intervaller på 200 ms, hvilket gav en ~ 50% embryo overlevelsesrate og effektiviteten af ​​plasmid-DNA målretning ind i BP. Fluorescerende billeddannelse af nativt GFP-ekspression i udviklingen embryoer viste denne metode til elektroporer…

Discussion

Den her beskrevne fremgangsmåde til in ovo mikro-elektroporering er optimeret til genoverførsel til det udviklende auditive orgel. Den er kompatibel med plasmid DNA-baserede ekspressionsvektorer, der typisk anvendes til at manipulere genfunktion / ekspression. Timingen af ​​elektroporation ved E4 er optimal for undersøgelser, der fokuserer på HC udvikling i det auditive orgel. De mest kritiske trin er mikro-injektion af DNA i øre- vesikel lumen uden at gå for dybt med nålen og beskadige otiske vesike…

Materials

Sterile 1x PBS pH 7.4	gibco	10010-023
Fast Green FCF Powder	Sigma	F7252-5G
EdU Powder	Invitrogen	E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit	Invitrogen	C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)	Qiagen	12643
ECM 830 ElectroSquarePorator	BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit	BTX Harvard Apparatus	45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators	World Precision Instruments Inc.	M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts	World Precision Instruments Inc.	M10
Metal Steel Base Plate 12×24 inch	World Precision Instruments Inc.	5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors	World Precision Instruments Inc.	14120
Micropippette Puller for pulling needles	Sutter Instrument Co.	P-97
2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament	Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm	FHC	27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl	Hamilton	80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe	Fisher Scientific	O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic	Becton Dickinson and Company (BD)	427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes	Becton Dickinson and Company (BD)	309657
Disposable 21 Gauge Needles	Becton Dickinson and Company (BD)	305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY611P3-2
Electrode Holder	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5	Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs	Office Depot	520-928
Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	23-400-101
Sterile filter tips