चिकन श्रवण अंग में जीन स्थानांतरण द्वारा<em> Ovo में</em> माइक्रो-electroporation
Summary
The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.
Abstract
चिकन भ्रूण भ्रूण के विकास के अध्ययन के रूप में जीन समारोह की जोड़तोड़ ओवो में रिश्तेदार आसानी से किया जा सकता है के लिए आदर्श मॉडल प्रणालियों रहे हैं। भीतरी कान श्रवण संवेदी अंग हमारे सुनने की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक अति विशिष्ट संवेदी उपकला कि mechano-transducing बालों की कोशिकाओं की (एचसीएस) होते हैं और आसपास के समर्थन कोशिकाओं (एससी) glial की तरह घरों। श्रवण अंगों में संरचनात्मक मतभेदों के बावजूद, आणविक श्रवण अंग के विकास के विनियमन तंत्र evolutionarily स्तनधारियों और एविस के बीच संरक्षित कर रहे हैं ओवो electroporation में काफी हद तक E1 पर प्रारंभिक दौर तक ही सीमित है। – E3। E5 पर श्रवण अंग के रिश्तेदार देर से विकास के कारण, पिछले E3 ओवो electroporation में से श्रवण अंग की जोड़तोड़ बाद के चरणों में चिकन भ्रूण के उन्नत विकास की वजह से मुश्किल हो जाता है। यहाँ प्रस्तुत विधि पर ब्याज की जीन को निशाना बनाने के लिए एक क्षणिक जीन स्थानांतरण विधि हैमंच इ 4 – ओवो सूक्ष्म electroporation में के माध्यम से विकासशील चिकन श्रवण संवेदी अंग में E4.5। इस विधि gain- और हानि के कार्यों पारंपरिक प्लास्मिड डीएनए आधारित अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ के लिए लागू है और कम से पूरे भ्रूण को edu (5-ethynyl 2'- deoxyuridine) जोड़कर ओवो सेल प्रसार परख के साथ जोड़ा जा सकता है electroporation का समय है। हरे या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP या आरएफपी) अभिव्यक्ति plasmids के उपयोग के प्रयोगकर्ता जल्दी से निर्धारित करने के लिए electroporation सफलतापूर्वक विकसित भीतरी कान की श्रवण हिस्से को निशाना बनाया या नहीं। इस विधि पत्र में, GFP electroporated नमूनों के प्रतिनिधि उदाहरण सचित्र हैं; electroporation के बाद 96 घंटा और श्रवण अंग के समर्थक संवेदी क्षेत्र के लिए GFP के लक्षित कर सीटू संकरण में शाही सेना द्वारा पुष्टि की गई – भ्रूण 18 काटा गया। विधि कागज भी अनुरूप edu सेल prolif का विश्लेषण करने के thymidine के उपयोग के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करता हैeration; कि इम्युनो-लेबलिंग को जोड़ती है और edu रसायन शास्त्र क्लिक एक edu आधारित सेल प्रसार परख का एक उदाहरण प्रदान की जाती है।
Introduction
और स्तनधारी और एवियन श्रवण संवेदी अंग के बीच सेलुलर patterning आकृति विज्ञान में मतभेद के बावजूद, आणविक कारकों और संवेदी कोर्ट विकास के लिए जिम्मेदार रास्ते evolutionarily 1-3 संरक्षित करने लगा रहे हैं। आधारी अंकुरक, जो श्रवण HCS और उनके आसपास के घरों में अनुसूचित जाति, भीतरी कान otocyst के एक outpocketing के रूप में विकसित करता है। प्रारंभिक कोर्ट और सुप्रीम कोर्ट पूर्वज का एक पूल पर कान का placode / कान कप तंत्रिका-संवेदी सक्षम डोमेन (एनएसडी) के भीतर निर्दिष्ट किया जाता है। किस्मत मानचित्रण डेटा सबूत है कि neuronal और संवेदी प्रजातियों जुड़ा हुआ है और एनएसडी कान कप के Antero उदर क्षेत्र में स्थित या चूहों और चिकन 4,5 में otocyst से उत्पन्न होती हैं प्रदान करते हैं। सबसे पहले, neuroblasts एनएसडी से delaminate श्रवण-vestibular नाड़ीग्रन्थि, जो अंततः श्रवण और vestibular गैन्ग्लिया में विभाजित के न्यूरॉन्स को जन्म देने के लिए। इन न्यूरॉन्स भीतरी कान और मस्तिष्क में नाभिक का संवेदी HCS अंदर आना। कोशिकाओं वेंपर एनएसडी में रहने mechano-transducing संवेदी HCS और उनके संबद्ध अनुसूचित जाति से मिलकर, श्रवण संवेदी अंग सहित विभिन्न संवेदी पैच, को जन्म देने के लिए लगा रहे हैं।
दोनों लड़की और murine में, श्रवण अंग संवेदी पूर्वज सेल चक्र से बाहर निकलें और कोर्ट भेदभाव ढ़ाल के विरोध में होते हैं। लड़की में, श्रवण पूर्वज सेल चक्र से बाहर निकलें ~ E5 के आसपास शुरू होता है और शीर्ष करने के लिए आधार से प्रगति, और केंद्र से परिधि से 6। एक दिन बाद, कोर्ट भेदभाव सर्वोच्च में शुरू होता है और बेस से 7 प्रगति। चिकन में भीतरी कान के विकास का अध्ययन कर के रूप में कार्य तंत्र ओवो के रूप में अन्य मॉडल प्रणाली में गर्भाशय, जो जटिल सर्जरी की आवश्यकता है में भ्रूण से छेड़छाड़ के लिए विरोध के रूप में रिश्तेदार आसानी से जांच की जा सकती है कई तकनीकी लाभ प्रदान करता है। विधि यहाँ वर्णित ओवो सूक्ष्म electroporation में उपयोग करता प्रकल्पित basila में ब्याज की जीन को लक्षित करने केविशेष रूप से E4 पर कान पुटिका में आर अंकुरक क्षेत्र पूर्वकाल पेट के बल।
ओवो electroporation में एक तकनीक है कि अच्छी तरह से स्थापित है और आमतौर पर 8-14 प्रयोग किया जाता है। Electroporation तकनीक के सिद्धांत तथ्य यह है कि न्यूक्लियोटाइड (जैसे, प्लास्मिड डीएनए, सिंथेटिक डीएनए, आरएनए या ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स) नकारात्मक आरोप लगाया जाता है पर आधारित है। डीएनए हित के ऊतकों में इंजेक्ट किया जाता है। एक विद्युत प्रवाह ऊतक भर में रखा जाता है, वर्तमान सेल दीवारों में क्षणिक pores खुल जाता है और के रूप में नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए सकारात्मक इलेक्ट्रोड (एनोड) की ओर बहती है, डीएनए के तेज के लिए अनुमति देता है। लाभ के समारोह के प्रयोगों के लिए, ब्याज की जीन सामान्यतः अभिव्यक्ति plasmids कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के लिए उपयुक्त अभिव्यक्ति कैसेट रोकने में subcloned रहे हैं। नुकसान के समारोह प्रयोगों प्लाज्मिड आधारित प्रमुख नकारात्मक repressor निर्माणों, या आरएनएआई, या morpholino निर्माणों के लिए ग रहे हैंommonly 15,16 इस्तेमाल किया। MicroRNA (miRNA) समारोह miRNAs स्पंज निर्माणों, जो आम तौर पर कर रहे हैं प्लाज्मिड आधारित बाधित करने के लिए, 17 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। के रूप में ओवो सूक्ष्म electroporation विधि में आसानी से पूरे भ्रूण को edu जोड़कर ओवो सेल प्रसार परख के साथ जोड़ा जा सकता है यहाँ वर्णित विधि, आणविक तंत्र है कि श्रवण अंग में प्रसार और भेदभाव पर नियंत्रण की जांच के लिए अनुमति देता है।
electroporation और edu के अलावा कान पुटिका, जो श्रवण अंग में सेल चक्र से बाहर निकलें की शुरुआत से पहले एक दिन में E4 पर किया जाता है। श्रवण अंग आम तौर पर 18 से प्रदर्शन किया है का विश्लेषण – E5 (संवेदी पूर्वज सेल चक्र से बाहर निकलें की शुरुआत), E6 (एचसी भेदभाव की शुरुआत), और E7 में electroporation के बाद 96 घंटा (एचसी भेदभाव के दौरान); और बाद में ~ E9 (एचसी भेदभाव के अंत में) करने के लिए। जीन स्थानांतरण के इस electroporation विधि, क्षणिक लगभग स्थायी ~ 4 दिनों का है becauएसई ब्याज की जीन जीनोम में एकीकृत नहीं है, लेकिन विधि उचित प्लास्मिड डीएनए आधारित अभिव्यक्ति वैक्टर, जो इस तरह के Tol2 की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण के रूप में 11, जीनोम में एकीकृत करने की क्षमता है के साथ प्रयोग के लिए लागू है। कोक्लीअ में 4 दिनों के लिए, जिसके बाद संकेतों बिंदु हो पाती है, अभी तक श्रवण अंग के जटिल विकास का अध्ययन करने के लिए एक पर्याप्त समय खिड़की प्रदान इस विधि मजबूत GFP या आरएफपी अभिव्यक्ति रहता है ~ के साथ। ओवो जीन स्थानांतरण विधि में इस उपन्यास है और विशेष रूप से E4 पर प्रकल्पित श्रवण अंग है, जो कि जांच श्रवण अंग में कोर्ट विकास पर ध्यान केंद्रित करने के लिए इष्टतम है लक्षित करने की अनुमति देता है। यह वैकल्पिक तरीकों, जो बहुत छोटी विकास के चरणों 11,12 या इन विट्रो आधारी papillae explant संस्कृतियों 18 के उपयोग की तुलना में electroporate करने के लिए एक अच्छा इसके अतिरिक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ओवो सूक्ष्म electroporation में की यहाँ वर्णित विधि को विकसित करने श्रवण अंग में जीन स्थानांतरण के लिए अनुकूलित है। यह प्लास्मिड डीएनए आधारित अभिव्यक्ति वैक्टर आमतौर पर जीन समारोह / अभिव्यक्ति में हेरफ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अभिव्यक्ति plasmids के लिए और सीटू जांच में डॉ डोरिस लालकृष्ण वू धन्यवाद, संवेदी जीवविज्ञान इमेजिंग सुविधा के लिए जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय केंद्र और सुनवाई और संतुलन के लिए केंद्र। इस काम के लिए ले NIDCD अनुदान T32 DC000023 द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | |
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 |
| Metal Steel Base Plate 12×24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 |
| 2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | |
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | |
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 |
| Sterile filter tips |
References
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
- Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
- Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
- Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
- Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
- Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
- Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
- Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
- Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
- Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
- Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
- Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
- Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
- Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
- Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
- Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
- Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
