Method Article

Opname Mouse Ultrasone geluiden om sociale communicatie Evalueer

DOI:

10.3791/53871

⸱

June 5th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Human Genetics and Cognitive Functions, University Paris Diderot, CNRS UMR 3571, Institut Pasteur, 2Neurophysiology and Behavior, University Pierre et Marie Curie Paris 6, CNRS UMR 7102, 3Bio Image Analysis, CNRS URA 2582, Institut Pasteur

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patiënten met neuropsychiatrische stoornissen meestal weer tekorten in de sociale communicatie (bijvoorbeeld patiënten met autisme spectrum stoornissen, schizofrenie, of de ziekte van Alzheimer) 1. Genetisch gemanipuleerde muizen worden steeds vaker gebruikt voor genetische oorzaken van deze aandoeningen 2 modelleren. Het bestuderen sociale communicatie in deze muismodellen is van groot belang voor het begrip van de mechanismen van de genetische mutaties die leiden tot atypische sociale stoornissen en voor het testen van nieuwe therapieën. Omdat muizen zijn sociale dieren en te communiceren met elkaar met behulp van olfactorische, tactiele, visuele en akoestische signalen, ze zijn geschikte modellen voor sociale communicatie te evalueren.

Mouse ultrasone geluiden worden nu nog gebruikt als proxy voor het modelleren van de genetische basis van vocale communicatie tekorten 3,4 (maar het bestaan ​​van vocale leren in deze soort is nog steeds gedebatteerd 5,6, zelfs als de meeste recente studies betooge voor de afwezigheid van oefendoeleinden 7). Laboratorium muizen zijn gevonden om ultrasone geluiden uit te stoten in de moeder-kind relaties, in man-vrouw socio-seksuele interacties, in hetzelfde geslacht sociale interacties (beoordeeld in verwijzing 8) en bij juveniele-juveniele sociale interacties 9. Muis pups uitstoten isolement oproepen tijdens hun eerste twee weken van het leven wanneer geïsoleerd van dam en nestgenoten 10. Mannetjes zenden ultrasone geluiden wanneer in aanwezigheid van een oestrus vrouwelijke (of urine-signalen uit haar) 11,12. Mannetjes en vrouwtjes zenden ultrasone vocalisatie bij de interactie met een onbekende soortgenoten van hetzelfde geslacht 13,14. De organisatie en de functies van deze geluiden zijn niet helemaal duidelijk en moeten verder onderzoek. Huidige kennis over het functionele aspect beperkt is tot het uitlokken van retrieval gedrag bij moeders horen pup isolatie dringt het vergemakkelijken van de nabijheid van volwassen vrouwen tegen volwassen mannelijke vocalizationen 15 en de toegenomen verkennende gedrag van de volwassen mannen horen volwassen vrouwtje vocalizations 16.

Karakteriseren van de afwijkingen in vocale communicatie in muismodellen van neuropsychiatrische aandoeningen moeten in gestandaardiseerde omstandigheden worden uitgevoerd om uit te sluiten belangrijke bijdrage van de experimentele omstandigheden. Dergelijke karakteriseringen, gecombineerd met de schatting van gelijktijdige sociale interacties en neurobiologische studies in verschillende genetische modellen moeten onze kennis over de genetische bijdrage aan de verschillende aspecten van de muis ultrasone communicatie te verbeteren. Over een lange termijn moet het verder licht te geven op een aantal neurobiologische basis van sociale communicatie bij de mens. We nu streven ernaar om eenvoudige protocollen betrouwbaar wekken ultrasone geluiden tijdens de ontwikkeling en in de volwassenheid voor zowel mannelijke als vrouwelijke muizen in het laboratorium. Dergelijke protocollen moeten de standaardisatie van opnames om meer betrouwbaar te vergelijken Ultr verlichtenAsonic stemgebruik emissies tussen stammen en laboratoria. Het moet ook het opzetten van dergelijke opnames in laboratoria hebben geen ervaring met de muis ultrasone geluiden opnames te vergemakkelijken. We hebben ook wijzen op de huidige mogelijkheid om ultrasone geluiden data te combineren met gedetailleerde behavioral data gelijktijdig verzameld tijdens sociale interacties in volwassen muizen, om cruciale informatie te verkrijgen over sociale beperkingen als op de context van de uitstoot van ultrasone geluiden. Dergelijke analyses zullen nieuw licht werpen op de organisatie en de functies van de muis ultrasone geluiden. Tot slot, wij adverteren ook de mogelijkheid om ultrasone vocalisatie opnames te delen met de hele wetenschappelijke gemeenschap op de mouseTube database (http://mousetube.pasteur.fr). Open toegang tot de audio-opname gegevens moeten kennis over de muis ultrasone communicatie stimuleren doordat wetenschappers om hun eigen gegevens te vergelijken met ultrasone geluiden opgenomen in andere laboratoria (met gelijke of verschillende stammen / protocols) en / of hun analysemethoden dagen met bestanden die onder verschillende omstandigheden.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek statement: Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door het Comité d'Ethique en experimenteren animale (CETEA) n ° 89 aan het Institut Pasteur, Parijs.

1. Dierlijke Voorbereiding

  1. Om pup isolatie gesprekken op te nemen, zwangere vrouwtjes te verkrijgen van de muis stam van belang. Let op: Ras heterozygote mannen en vrouwen ten minste 10 nesten met inbegrip van wild-type te verkrijgen, heterozygote en knock-out pups om robuuste controle dieren te verkrijgen.
  2. Het verkrijgen van twee categorieën van volwassen muizen aan geluiden tijdens hetzelfde geslacht interacties op te nemen.
    1. Verkrijgen van ten minste 12 mannetjes en 12 vrouwtjes van elk genotype proefmuizen van de stam van belang (om rekening te houden interindividuele variabiliteit). Opmerking: Dit protocol staat geschikt voor volwassenen, maar kan worden aangepast om jeugdigen met verminderde isolatie tijd voordat het experiment 9. Deze test werkt voor mannen of vrouwen. Vermijd echter het testen mannelijkes van de muis stammen die een duidelijke agressieve fenotype in de man-man sociale interactie-test weer te geven.
    2. Om de hoeveelheid affiliatief interacties te maximaliseren, isoleren de proefdieren voor de experimenten. Huis mannetjes individueel 3 weken (agressieve interacties tot een minimum te beperken 14,17) en vrouwen gedurende 3 dagen (Ey E., ongepubliceerde gegevens) hun sociale motivatie.
    3. Verkrijgen mannen of vrouwen van stammen vertegenwoordiger van de genetische achtergrond van de teststam om ze te gebruiken als nieuwkomers (bijvoorbeeld de interactie muizen, zie 3.1.3). Indien bijvoorbeeld de mutante stam werd onderzocht werd gegenereerd op de C57BL / 6J achtergrond, gebruikt C57BL / 6J muizen nieuwkomers. Bereken het aantal dieren nodig zodat elk van deze muizen niet meer dan 2 keer per dag als nieuwkomer. Huisvesten ze in groepen.
  3. Het verkrijgen van twee categorieën van volwassen muizen aan mannelijke geluiden op te nemen in aanwezigheid van een oestrus vrouwelijke.
    1. Verkrijgen tegen loosten 12 geslachtsrijpe mannetjes uit elk genotype van de stam van belang (om rekening te houden inter-individuele variabiliteit). Opmerking: Als de mannetjes nooit ervaring met vrouwen hebben gehad, leg ze in individuele kooien en laat ze besteden een nacht met een vrouw twee dagen voor de test om hun motivatie om ultrasone geluiden 6 uitstoten verhogen.
    2. Verkrijgen geslachtsrijp vrouwtjes van de achtergrond stam van de opgenomen mannetjes. Bijvoorbeeld, als de mutant mannetjes bestudeerd hebben gegenereerd de C57BL / 6J achtergrond, gebruikt C57BL / 6J vrouwtjes. Bereken het aantal vrouwtjes nodig zodat elk van deze muizen niet voor meer dan 3 keer per dag. Huisvesten ze in groepen.

2. Pup Isolation Gesprekken

  1. pup Identificatie
    1. Drie dagen voor de verwachte geboortedatum, isoleren de zwangere vrouwtjes.
    2. Controleer de vrouwtjes voor de geboorte elke ochtend en elke avond. Let op de dag van de geboorte als P0.
    3. Identificeer de pups bij P1 met behulp van langdurige paw tatoeages (subcutane injectie van groene tattoo pasta met een 0,3 mm x 13 mm [30 G ½ "] naald). Maak een code met één, twee, drie of vier poten gemarkeerd. Wees zo snel mogelijk, om minimaal verstoren de pups, en zet ze terug in het nest zo spoedig mogelijk.
  2. Stel de Kooi om Record Pup Isolation Calls.
    1. Gebruik ofwel een self-made geluidsdichte kamer (Figuur 1A) of een eenvoudige piepschuim doos. Plaats een thermometer in het vak aan de temperatuur voor elke opname te controleren. Zorg ervoor dat de temperatuur blijft tussen de 18 ° C en 22 ° C.
    2. Plaats een microfoon boven (door een gat in de bovenzijde van de box). Stel de hoogte van de microfoon, zodat het membraan van de microfoon is 12-15 cm boven de bodem van de doos waar de pup zal liggen. Sluit de microfoon aan op de geluidskaart, en de geluidskaart van de computer.
    3. Om de winst van de sou aan te passennd kaart, voeren een opname proef met een pup die niet wordt gebruikt in het experiment. Zet de pup in dezelfde omstandigheden als in het experiment (zie 2.3.1). Doe de deur dicht. Regel de versterking van de geluidskaart, zodat het op de maximumwaarde zonder overbelasting (controleer op de live spectrogram weergave van de opnamesoftware) (de hoogst mogelijke amplitude voor vocalisaties hebben).
      Opmerking: Een paar telefoontjes kan worden overbelast wanneer de amplitude van de meerderheid van de gesprekken op het hoogste niveau mogelijk te houden.
    4. Registreer de winst voor elk opnamesessie en het niet wisselen tussen jongen / nesten / sessies. Variaties in winst niveaus zou leiden tot onjuiste oproep detectie en akoestische variabelen maatregelen met dezelfde drempels in de analyses met behulp van automatische detectie en metingen (zie 5.1 tot 5.4).

figure-protocol-1
Figuur 1: Stel voor het opnemen van isolatie oproepen van de muis pups en spectrogrammen van ultrasone geluiden (A) Voorbeeld van een self-made geluiddichte kamer naar pup isolatie gesprekken op te nemen.. (B) Spectrogrammen van de verschillende soorten oproepen gebruikt in de onderhavige soort oproep indeling; zie beschrijving in tabel 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Het gedrag van de registratie van de pup isolatie vraagt ​​om de twee dagen. Gedrag opnames in de ochtend voor pups geboren in de nacht, en in de namiddag voor pups geboren tijdens de dag om te categoriseren in dezelfde leeftijdsklasse pups te voorkomen met een halve dag verschil in leeftijd. Dit is het meest merkbaar voor de zeer jonge stadia P2 en P4.
    1. Neem een ​​pup in het nest. Plaats deze zo snel en voorzichtig mogelijk in een plastic ontvanger gewassen met ethanol 10% en gedroogd (diameter: 9cm; hoogte: 10 cm om te voorkomen dat oudere pups te ontsnappen uit het gebied dat door de microfoon). Zet de ontvanger net onder de microfoon.
    2. Sluit de doos zo snel en geruisloos mogelijk. Start de opname van de pup ultrasone geluiden in de opname-software (16-bits-formaat, 300 kHz sampling frequentie geluid amplitude tot 150 kHz met een hoge kwaliteit vast te leggen).
    3. Na de vereiste tijd van de opname (maximaal 5 minuten) is verstreken, stopt de opname. Neem de pup uit de doos. Noteer de poot tatoeages van de pup.
    4. Neem de oksel temperatuur van de pup met een probe-thermometer. Markeer de pup op zijn rug met een klein punt met een geur-less pen (water inkt), te herkennen gemakkelijker de reeds opgenomen pups in het nest wanneer de volgende wordt gekozen en om te voorkomen dat het manipuleren van alle pups elke keer een nieuwe is gekozen. Zet de pup terug in het nest.
    5. Was de plastic ontvanger en het plastic omhulsel zijn bodem met 10% ethanol en droog het goedvoordat de volgende pup binnenkant.
    6. Kies de volgende pup in het nest en herhaal 2.3.
  2. Controleer lichaamsgewicht, motorische coördinatie, negatief geotaxis, en ontwikkelingsstoornissen merken (voor details van de gereduceerde testbatterij zie de methode secties Schmeisser et al. 18 en in Ey et al. 19) na een rusttijd van 1 uur mogelijk te maken de pups om te herstellen na de uitputtende uitstoot van ultrasone geluiden. Gebruik een andere cohort van dieren als de volledige ontwikkelingsstoornissen testbatterij zoals in Chadman et al. 20 en Scattoni et al. 21 wordt uitgevoerd.
  3. Herhaal deze opnames om de twee dagen tussen P2 en P12 te jong vocaal gedrag en de ontwikkeling karakteriseren tijdens hun eerste twee weken van het leven.

3. Ultrasone geluiden tijdens hetzelfde geslacht sociale interacties

  1. vocalization Recordings
    1. Bereid een test kooi (50 x 25 cm x 30 cm 3; Plexiglas, 100 lux [lage intensiteit wit licht]) gereinigd met zeep water, gedroogd en gevuld met 2 cm verse beddengoed in de geluiddichte kamer.
      1. Plaats de microfoon, zodat vocalizations uitgezonden vanuit alle hoeken van de kooi kan worden opgenomen. Bevestig de microfoon in een hoek van de testkooi (op de kooi of op een statief) en stel de hoek microfoon kooibodem op gehele oppervlak van de kooi zijn geplaatst.
        Let op: Echo zijn sterk gerichte.
      2. Plaats een videocamera op de bovenkant van de geluiddichte kamer naar het gehele oppervlak van de testkooi vangen.
        Let op: Controleer of de microfoon een hoek van de test kooi op de video niet is ondergedoken.
      3. Voor de proef, aan te passen aan de versterking van de geluidskaart met een extra mannelijk en een reserve vrouwtje dat zal niet in het experiment later gebruikt worden. Zet deze dieren in de test kooi in de opname kamer. Stel het versterkingsniveau van de geluidskaart om de amplitude van de opgenomen geluiden te maximaliseren but minimaliseren overbelasting zoals in het levende spectrogram display van de opname software.
        Opmerking: De winst is afhankelijk van de afstand tussen de microfoon en de vocalizing dieren.
    2. Introduceer het dier te testen (mannelijk of vrouwelijk, het zal de "bewoner" worden genoemd) in de test kooi op verse beddengoed. Laat het wennen aan de test kooi in de geluiddichte kamer voor 20 min om zijn belangstelling voor het onbekende soortgenoten geïntroduceerd in 3.1.3 te maximaliseren.
    3. Na deze gewenning tijd, introduceren de 2e dier voor de interactie (man of vrouw, van hetzelfde geslacht als de bewoner, maar verschillende oormerken / poot tattoo om ze later te identificeren, het zal de "nieuwkomer" worden genoemd).
      1. Registreren van de ultrasone geluiden en video (16-bit formaat, 300 kHz samplefrequentie geluidsamplitude tot 150 kHz met een hoge kwaliteit te maken) bij de invoering van de nieuwe-hoek in de testkooi vangen. Begin met opnemen op de ultrasonic geluiden tijdens de gewenning (bewoner alleen) als een vergelijking tussen het basisniveau van stemgebruik emissie tijdens de verkenning kooi en de sociale interactie nodig is.
      2. Synchroniseer handmatig / visueel de audio- en video-opnamen door op de tijd horloge ( "piep" geluid in de buurt van de microfoon) precies wanneer de achterpoten van de nieuwkomer muis de grond raken.
      3. Laat de twee dieren interactie voor de gewenste tijd (bijvoorbeeld 4 min, een tijdsduur voldoende om genoeg ultrasone geluiden te verzamelen).
    4. Doe de inzittende en de nieuwkomer terug in hun eigen kooien. Leeg het strooisel uit de test kooi, wassen met water en zeep en droog het met keukenpapier. Zet vers strooisel en plaats het terug in de geluiddichte kamer voor de volgende test.

4. Man vocalizations Tijdens Interactie met een Estrus Female

  1. Vroeg in de ochtend op de dag van het testen van demannetjes, neem vaginale uitstrijkjes van elke vrouw naar hun seksuele status binnen de estrus cyclus te bepalen.
    1. Houd het vrouwtje bij de staart en haar te behouden op de kooi net. Gebruik een pipet om de vagina meerdere malen spoelen met 20 pl PBS (dwz injecteren en herinneren dezelfde 20 pl PBS meermaals). Herinner u de 20 ul PBS met dezelfde pipet tip. Gebruik steriele PBS, om een ​​infectie te vermijden als vrouwen moeten worden getest op een aantal opeenvolgende dagen.
    2. Verdeel de PBS dat de opschorting van de vaginale cellen op een dia. Zet vier monsters op een slede (identificatie van de personen aan de zijde van de schuif met een potlood). Laat de dia's drogen voor het uitvoeren van de kleuring.
    3. Werken onder het laboratorium zuurkast.
      1. Bereid een bad van zuiver May-Grünwald, een bad van fosfaatbuffer (0,1 M) en een bad van Giemsa R (1/20 in fosfaatbufferoplossing).
      2. Zet de objectglaasjes in het bad van pure May-Grünwald gedurende 3 min, vervolgensspoelen in het bad fosfaatbuffer oplossing voor 1 min en tenslotte overbrengen voor 10 min in het bad van Giemsa R (1/20 in fosfaatbufferoplossing).
      3. Daarna, spoel de dia's weer in het bad van fosfaatbufferoplossing gedurende 10 seconden en laat ze drogen.
    4. Onderzoek de gekleurde dia's onder de microscoop. Vrouwtjes die gebruikt kunnen worden in de loop van de dag zijn die waarvan de monsters aanwezig zijn enige grote verhoornde epitheelcellen (zonder kern, gekleurd in blauw, vol bronsttijd).
  2. Zet de mannetjes in de testruimte ten minste 30 minuten vóór het testen van hen.
  3. vocalization Recordings
    1. Herhaal 3.1 indien nodig.
    2. Introduceer de man te testen (op vers strooisel). Laat hem wennen aan de test kooi in de geluiddichte kamer gedurende 10 min.
    3. Na deze gewenning tijd invoering van een vrouw in estrus (onder de geselecteerde uit de vlekken zijn).
      1. Beginnen met het opnemen van de ultrasone geluiden en videode invoering van de vrouw in de testkooi vangen. Beginnen met het opnemen van de ultrasone geluiden tijdens de gewenning (man alleen) als een vergelijking tussen het basisniveau van stemgebruik emissie tijdens de verkenning kooi en de sociale interactie nodig is.
      2. Synchroniseer handmatig / visueel de audio- en video-opnamen door op de tijd horloge ( "piep" geluid in de buurt van de microfoon) precies wanneer de achterpoten van de vrouwelijke muizen de grond raken.
      3. Laat de twee dieren interactie voor de gewenste tijd (bijvoorbeeld 4 min, een tijdsduur voldoende om genoeg ultrasone geluiden te verzamelen).
    4. Doe de mannelijke en de vrouwelijke terug in hun eigen kooien. Leeg het strooisel uit de test kooi, wassen met water en zeep en droog het met keukenpapier. Zet vers strooisel en plaats het terug in de geluiddichte kamer voor de volgende test.
      Opmerking: Het is optimaal om elk oestrus vrouwelijke slechts één keer per dag (maar indien nodig het kanworden tot 3 keer op dezelfde dag, maar niet in een rij).

5. Variabelen te extraheren

  1. Bereid je audio-bestanden voor de analyses. Opmerking: De onderstaande procedure is specifiek voor een ViSoft SASlab Pro en kunnen veranderen afhankelijk van de gebruikte software.
    1. Snijd de bestanden, zodat ze precies beginnen bij de "piep" van de tijd horloge, en eindigt na de gewenste duur (5 min voor jong opnames, 4 min voor volwassen opnames).
    2. Filteren de amplitude onder de 30 kHz met behulp van een high-pass filter (Edit> Filter> FIR Time Domain Filter, High Pass met 30 kHz frequentie afgesneden). Gebruik batchverwerking om alle bestanden van belang (Actions> Batch Processing> FIR filter) filteren.
    3. Identificeer elke ultrasone vocalisatie door ze te labelen met de software.
      1. Gebruik automatische detectie voor pup opnames (Extra> Labels> Maak sectie labels uit golfvorm evenementen). Pas de drempel, de tijd en de marge f houdenof de meest nauwkeurige detectie. Handmatig controleren de opsporing en de labels aan te passen indien nodig (aanbevolen).
      2. Gebruik visuele detectie (handmatige invoer van labels) voor volwassen opnames met achtergrondgeluid (selecteer de geluiden, klik met de rechtermuisknop, en steek inzetlabel van marker).
    4. Maak de spectrogram. Activeer de automatische parameter metingen (Extra> Automatic Parameter Metingen> Automatische Parameter metingen Instellen).
    5. Controleer de "Enable automatische metingen", de "Compute parameters van gehele spectrogram", en de "Automatic Update" boxen. Selecteer "Element scheiding": interactief (paragraaf labels).
    6. Controleer dozen om de gewenste tijdelijke parameters (duur van het element, Interval, Start / Eindtijd) en-spectrum op basis van parameters (Peak frequentie), en de locatie van de metingen (Start van het element, End of element, Mean, Max, Min) te berekenen .
    7. Kopieer de metingen en plak dem in een spreadsheet.
      Opmerking: Voor opnames uitgevoerd bij volwassenen, kunnen metingen van-spectrum gebaseerde parameters onmogelijk zijn als gevolg van achtergrondgeluid. Gebruik handmatige metingen van de piek frequentie door te klikken op de verschillende frequentie waarden direct op de spectrogram en handmatig plakken van de waarden in een tabel.
  2. Bepaal call rate, dat wil zeggen, het aantal oproepen per minuut door eerst het aantal geluiden uitgezonden (totaal aantal labels) het bepalen. Vervolgens berekenen van de call rate door het totale aantal geluiden opgenomen door de tijdsduur (in minuten) van het bestand te delen.
  3. Bepaal tijdelijke organisatie, dat wil zeggen, de verdeling van tijdsintervallen tussen gesprekken sequentie organisatie te bepalen.
    1. Bereken het tijdsverloop tussen het einde van de vocalisatie n en het begin van de vocalisatie n + 1 met de start / eindtijd van elk etiket.
    2. Bepaal de verdeling dichtheid van de tijdsintervallen tussen Ultrasonic geluiden.
  4. Bepaal oproep repertoire, dat wil zeggen, bepalen het type gesprek aanwezig zijn in de opname. Het voorbeeld van de indeling in tabel 1 en figuur 1B.
    1. Tijdens het benoemen van elke vocalisatie in 5.1.3, de naam van het type oproep in het label.
    2. Bereken het exacte aantal en het aandeel van elk type oproep om de vocale repertoire op te bouwen.
  5. Bepalen akoestische eigenschappen voor elke vocalisatie, dwz duur, piekfrequentie (dwz frequentie met de hoogste amplitude) aan het begin en het einde van het gesprek, maximum en minimum piekfrequentie en gemiddelde frequentie als de automatische meting mogelijk (Figuur 1B) .
    1. De automatische parametermetingen functie in de software automatisch duur, piek frequentiekarakteristieken meten (bijvoorbeeld start, einde, gemiddelde, maximum, minimum) puppygewicht opnamen.
    2. Gebruik de duur van het label de duur van de vocalisatie bij volwassen opnamen. Meet met de hand op het spectrogram venster de piek frequentie kenmerken (bv, start, einde, maximum, minimum).
  6. Paar ultrasone vocalisatie data en sociale interactie data (MiceProfiler plugin van de ICY platform 22).
    1. Zorg ervoor zo nauwkeurig synchroniseren mogelijk de audio- en video-opnames zoals beschreven in het protocol.
    2. Coderen van de video van de sociale interactie met behulp van de Muizen Profiler Tracker plugin van de ICY platform, zoals beschreven in de Chaumont et al. 22. Start de tracking precies wanneer de achterpoten van de binnengebrachte dier de grond raken.
    3. Upload de gecodeerde video-bestand en de bijbehorende XML-bestand (gegenereerd door Mice Profiler Tracker) in de muizen Profiler Video Label Maker plugin van de ICY platform, zoals beschreven in de Chaumont etal. 22.
      Opmerking: De Mice Profiler Video Label Maker plugin zal automatisch de video-bestand en het tekstbestand gegenereerd op basis van de analyse van het audio-bestand als ze dezelfde naam te koppelen (zie: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker) .
    4. Na het controleren dat de muis schaal correct is, klikt u op "Create USV statistieken" voor elk bestand om het aantal en het aandeel van de geluiden die tijdens elke sociale gebeurtenis in een apart bestand te krijgen.

6. Bestanden uploaden op de mouseTube Database

  1. Zorg ervoor dat de bestanden op een opslagserver die gebruikt kan worden van buiten de instelling.
    Opmerking: servers gehost in sommige instellingen met een hoog veiligheidsniveau zal een specifieke configuratie nodig bereikbaar met het verbinden van mensen van buiten de instelling te zijn.
  2. Ga naar de website mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Log in (login eennd wachtwoord worden toegeschreven aan elke gebruiker van de beheerders).
  3. Controleer of de muis stam reeds opgenomen bestaat in de mouseTube databank door te klikken op de knop "Stammen". Zo niet, vraag de beheerders om het te maken.
  4. Maak proefpersonen met behulp van de "Subjects>" knop. Voer de identificatiecodes van de dieren opgenomen. Verzamel ze in groepen om later ophalen van gegevens te vergemakkelijken.
  5. Voer de beschrijving van het protocol dat wordt gebruikt om ultrasone geluiden met behulp van de op te nemen "Protocollen> Create" knop.
  6. Maak een experiment voor elke opname sessie met behulp van de "Experimenten> Create" knop. Geef het protocol, de groep van personen, die is opgenomen, de gebruikte hardware en software en hun specifieke kenmerken.
    Opmerking: Het experiment verzamelt alle metadata die overeenkomt met de vocalisatie bestanden.
  7. Maak de link naar de vocalisatie bestanden met behulp van de "vocalisaties> Create & #34; knop. Selecteer het experiment in de lijst. Kopieer en plak de url van de vocalisatie bestand (deze link begint met http: // ...) in het overeenkomende veld van de kolom "bestanden te koppelen". Valideren van de inzendingen door te klikken op de knop "Een koppeling tussen mouseTube en de bestanden".
    Opmerking: Het is niet nodig om elke box voor elk bestand vullen tegelijk.
  8. Indien nodig, aan te passen de links op ieder moment ingevoerd en details toe te voegen in de sectie "Notes". Aarzel niet om te schrijven notities om meer details te geven. Als bijvoorbeeld een koppeling naar een videobestand gelijktijdig werd opgenomen met het audiobestand is ingevoerd, kan worden gespecificeerd in de "Notes".

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de huidige protocollen, we karakteriseerde de vocale gedrag van muizen ontbreekt ProSAP1 / Shank2, een gen geassocieerd met autisme spectrum stoornissen (ASS) 23-25. ASD worden gekenmerkt door tekorten in de sociale communicatie en stereotype gedragingen 1. Onze Shank2 - / - muizen weergegeven hyperactiviteit, verhoogde angst en atypische vocale communicatie 18,26. Sterker nog, we hebben geconstateerd dat Shank2 - / - muizen verschijnt een atypisch ontwikkelings-profiel in hun emissie van pup isolement oproepen in vergelijking met de typische omgekeerde U-vormige curve in hun wild-type nestgenoten Shank2 -. / - Muizen getoond een verhoogde call rate bij P4 en verminderde gesprekstarief op P6 in vergelijking met hun wild-type nestgenoten (figuur 2). We zagen ook een verminderde call rate bij vrouwelijke interacties met een Shank2 - / - vrouw in VERGELIJKIn met interacties van een wild-type littermate (figuur 2). We hebben gekeken naar het repertoire van de 5 verschillende call categorieën. Het bleek verschillend tussen pups (bijvoorbeeld hier P2, P6 en P10) en volwassenen (figuur 3) te zijn. -Genotype gerelateerde verschillen significant waren meestal in volwassenheid. Tijdens sociale interacties van volwassen Shank2 - / - mannen of vrouwen met een C57BL / 6N vrouwen werden meer korte gesprekken en ongestructureerde gesprekken die in vergelijking met de omgang met hun wild-type nestgenoten (Figuur 3D en E). Minder complexe oproepen en frequentie springt gesprekken werden opgenomen tijdens interacties met een C57BL / 6N vrouw met volwassen Shank2 - / - vrouwen in vergelijking met de interacties van Shank2 + / + vrouwen (figuur 3E). Tot slot hebben we ook gemeten handmatig akoestische variabelen. Er was geen significant-genotype samenhangend verschil during ontwikkeling. In tegenstelling, de duur van gesprekken die tijdens interacties van volwassen Shank2 - / - vrouwtjes waren korter dan die opgenomen tijdens interacties met hun wild-type nestgenoten (Figuur 4A). We hebben ook benadrukt dat de piek frequentie van ultrasone geluiden verhoogd tijdens pup ontwikkeling zonder noemenswaardige-genotype samenhangend verschil 26. Tijdens interacties met Shank2 - / - mannen of vrouwen met een C57BL / 6N vrouw, ultrasone geluiden had een lagere piek frequentie in vergelijking met de gesprekken opgenomen tijdens interacties met hun wild-type nestgenoten (Figuur 4B).

Daarnaast heeft de onderhavige protocol ook toegestaan ​​om de context van de emissie van ultrasone geluiden bestuderen door het combineren van de data van geluidsopnamen de gedragsgegevens onttrokken MiceProfiler (ICY software, Institut verledeneur, Parijs). Bijvoorbeeld, in twee vrouwelijke interacties, werden de meeste ultrasone geluiden te horen als de dieren in contact en meer in het bijzonder de bewoner snuiven ano-genitale gebied van de nieuwkomer waren, of in ieder geval de bewoner zijn achter de nieuwkomer. Muizen ook uitgestoten veel ultrasone geluiden wanneer de bewoner benaderde de nieuwkomer (Figuur 5, bovenste paneel). Minder geluiden werden opgenomen toen de bewoner Shank2 - / - muizen waren in fysiek contact met de nieuwkomer (bv, snuiven de ano-genitale gebied van de nieuwkomer) dan wanneer de bewoner was een wild-type muis. Minder geluiden werden geactiveerd wanneer de bewoner achter de nieuwkomer was een Shank2 - / - muis dan toen het nog een wild-type muis. Meer geluiden werden geregistreerd wanneer de nieuwkomer was in het gezichtsveld van de bewoner muis, en meer in het wild-type dan in de mutanten (Figuur 5, onderste paneel).

s = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> figure-results-1
Figuur 2:. Emissie van ultrasone geluiden tijdens de ontwikkeling en in volwassen mannelijke en vrouwelijke Shank2 - / - muizen en wild-type nestgenoten Bel snelheid van pups (om de twee dagen van P2 tot P12, n = 18-19 Shank2 + / +, n = 15-16 Shank2 - / -) en volwassenen in man-oestrus vrouwelijke interacties (n = 15 Shank2 + / +, n = 16 Shank2 - / -) en vrouwelijke uiteinden interacties (n = 15 Shank2 + / +, n = 13 Shank2 - / -) in wild-type muizen (linker paneel) en Shank2 - / - muizen (rechter paneel). Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde +/- SEM en afzonderlijke punten (niet-gepaarde Wilcoxon test: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).ge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3:. Vocale repertoire van Shank2 - / - muizen en wild type nestgenoten aandelen van de vijf verschillende soorten oproepen afkomstig van P2 pups (A; n = 20 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 - / -), P6 pups (B; n = 19 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 - / -), P10 pups (C; n = 20 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 - / -), volwassen mannen met een oestrus vrouwelijke (D ; n = 16 Shank2 + / +, n = 16 Shank2 - / -) en volwassen vrouwen met een vrouwelijke (E; n = 15 Shank2 + / +, n = 13 Shank2 - / -) in wild-type muizen (links panelen) en Shank2 - / - muizen (rechter panelen). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde +/- SEM en individuele punten (chi-kwadraat testen: * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4:. Akoestische variabelen onttrokken ultrasone vocalisatie in Shank2 - / - muizen en wild type nestgenoten (A) Duur van alle soorten oproepen verward uitgeschreven door P2 pups (n = 20 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 - / - ), P6 pups (n = 19 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 - / -), P10 pups (n = 20 Shank2 + / + , n = 18 Shank2 - / -), volwassen mannen met een oestrus vrouwelijke (n = 16 Shank2 + / +, n = 16 Shank2 - / -) en volwassen vrouwen met een vrouwelijke (n = 15 Shank2 + / +, n = 13 Shank2 - / -) in wild-type muizen (linker paneel) en Shank2 - / - muizen (rechter paneel). (B) Maximale piek frequentie gemeten op alle soorten oproepen beschaamd in P2 pups, P6 pups, P10 pups, volwassen mannen met een oestrus vrouwelijke en volwassen vrouw met een andere vrouw (zelfde Ns als hierboven). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde +/- SEM en individuele punten (niet-gepaarde Wilcoxon test: * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 5: Context. s van de emissie van de muis ultrasone geluiden in female-vrouwelijke volwassen sociale interacties Aandeel van de ultrasone geluiden uitgezonden door paren met een Shank2 + / + met een C57BL / 6N muis (n = 16, A) en paren met een Shank2 - / - met een C57BL / 6N muis (n = 13, B) tijdens de volgende soorten behavioral evenementen (rood: bewoner, groen: nieuwkomer): sociale contacten, oro-oraal contact, ano-genitale snuiven van de bewoner muis, baar genitale snuiven van de nieuwkomer muis, bewoner achter nieuweling, nieuwkomer achter bewoner, onbeweeglijkheid van de bewoner, immobiliteit van nieuwkomer, aanpak van de bewoner en ontsnappen aan de nieuwkomer, aanpak van de nieuwkomer & ontsnappen aan de bewoner, aanpak en ontsnappen aan de bewoner, aanpak en ontsnappen aan de nieuwkomer, bewoner naar aanleiding van de nieuwkomer, nieuwkomer in het gezichtsveld van de bewoner, bewoner in het gezichtsveld van de nieuwkomer. De gegevens zijn pwoordigd als gemiddelde +/- SEM en afzonderlijke punten (niet-gepaarde Wilcoxon test: * p <0,05, ** p <0,01). Ongepubliceerde gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

call types Beschrijving
kort duur ≤5 msec en frequentiebereik ≤6.25 kHz
eenvoudig duur> 5 msec en frequentiebereik ≤6.25 kHz (plat), of de frequentie modulatie slechts in één richting (naar boven of naar beneden) met een frequentiebereik> 6.25 kHz
complex frequentiemodulaties in meer dan één richting en frequentiebereik> 6,25 kHz (gemoduleerd), of opname van een of meer additionele frequentie component (harmonische of niet-lineaire verschijnselen, maar geen verzadiging) maar geen beperking voor frequentiebereik (complex)
frequentie sprongen opneming van een jump (één frequentie sprong) of meer sprongen (frequentie sprongen, andere) in de frequentie zonder tijd tussen de opeenvolgende frequentie componenten, met een (gemengde) of zonder enig luidruchtige gedeeltelijk binnen de zuivere toon oproep
ongestructureerde geen zuivere toon component identificeerbaar is; "Noisy" gesprekken

Tabel 1:. Kenmerken van de vijf soorten muizen ultrasone geluiden Voorbeelden van criteria van de duur, frequentie bereik, de frequentie modulaties en frequentie sprongen gebruikt om 5 verschillende soorten oproepen binnen muis ultrasone geluiden te bepalen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier gepresenteerde biedt gestandaardiseerde en betrouwbare manieren om muizen ultrasone geluiden te verzamelen in het laboratorium. Deze zeer beperkte situaties presenteren het voordeel van standaardisatie. Ze worden gebruikt met succes aan stammen of genotypen binnen stammen 18,19,26,27 te vergelijken. Zoals gepresenteerd in de representatieve resultaten, deze methoden kan de identificatie van atypische sociale communicatie bij muizen gemuteerd voor Shank2, een gen geassocieerd met autisme spectrum stoornissen. Vergelijkingen tussen muizenstammen tussen verschillende contexten of zelfs tussen laboratoria wordt geactiveerd door de beschikbaarheid van grote datasets op mouseTube database. Dit instrument moet onderzoeken op de muis ultrasone geluiden te verhogen doordat multivariate analyses.

De hier beschreven protocollen worden geoptimaliseerd om muizen van verschillende genotypen te testen in een stam, zoals in de meeste studies gedaan modelleren van de genetische cIJDRAGE neuropsychiatrische aandoeningen. Aanbevolen wordt experimenteel ontwerpen elke studie om de beste controles. Sterker nog, misschien strooisel effecten maskeren of kunstmatig genetische effecten 28,29. Het is daarom raadzaam om nestgenoot controles omvatten voor elk genotype. Fokken van heterozygote ouders moeten daarom de voorkeur, omdat het de juiste afstemming van mutant en controle muizen binnen een nestje zal toestaan. Dit rechtvaardigt de poot tattoo markering van alle pups (blind voor genotype) om personen te volgen gedurende de opnames om de twee dagen. Genotypering wordt gedaan bij het spenen, door het nemen van monsters staart. Bij het opnemen van pup isolement oproepen van P2 op, zouden we niet aanraden om staart monsters al in pups, omdat deze operatie omvat aanvullende manipulatie en stress zeer dicht in de tijd naar een opnamesessie.

De protocollen die hier voorgesteld om ultrasone geluiden op te wekken bij volwassenen niet mogelijk een duidelijke identificatie van het EMItter van de geluiden. Dit verklaart waarom we de motivatie van het proefdier te manipuleren. Inderdaad, worden de test muizen geïsoleerd en geen nieuwkomer en proefdieren gewennen gedurende een lange tijd om de testkooi tijdens hetzelfde geslacht interacties. In man-vrouw interacties, de geïntroduceerde vrouwtje is niet geïsoleerd en de test mannelijke went voor kortere tijd sinds motivatie hoger in deze seksuele context. Deze manipulaties motivatie dient de waarschijnlijkheid van de testmuis emitterende de geluiden en niet de geïntroduceerde één maximaliseren. Om mannelijke ultrasone geluiden op te nemen in een seksuele context, een eenvoudig wattenstaafje met verse (dus niet ingevroren) urine van een oestrus vrouwelijke kan ook worden in de kooi 30 geïntroduceerd. Deze werkwijze maakt de overdracht van ultrasone geluiden naar test man met 100% zekerheid maar voorkomt verzamelen van specifieke gegevens over de werkelijke sociale context van de emissie van deze vocalisaties. Daarom geven we de voorkeur aan de protocol hier beschreven (met een vrij bewegende oestrus vrouwelijke). We ook aan om altijd ingevoerd muizen van dezelfde stam bij het testen muizen uit een mutante stam en de gegevens te analyseren als een paar muizen vocalizing. Een recente studie bevordert het gebruik van triangulatie met de emitter 31 lokaliseren. In deze studie werden vrouwen gevonden om ook uit te stoten ultrasone geluiden tijdens ontmoetingen met een mannelijke. Dit kan worden verklaard door het feit dat ze werden geïsoleerd gedurende ten minste twee weken vóór de opnamesessie. De veralgemening van het gebruik van de in deze studie voorgestelde triangulatie moet toch mogelijk maken de identificatie van de emitter van de geluiden in de meeste gevallen, als video-opnamen correct worden gesynchroniseerd.

Het isolement oproepen van pups opgenomen tijdens de ontwikkeling worden niet verstoord door achtergrondgeluiden van het beddengoed. Gewoonlijk wordt een automatische analyse werkt erg goed naar de belangrijkste variabelen te extraheren. In tegenstelling geluiden opgenomen van volwassenen zijn disturbed door achtergrondgeluiden van de dieren bewegen in het beddengoed. Automatische analyse uitvalt en daarom handmatige analyse worden gebruikt. Niettemin, het toevoegen van beddengoed in de test kooi moeten voorwaarden die minder belastend voor de dieren dan kale grond (dat muizen niet bevalt) zijn voorzien. Verdere inspanningen in de gemeenschap zijn gericht op het verbeteren van de automatische detectie van ultrasone geluiden onder verschillende omstandigheden, zelfs die impliceren achtergrondgeluiden. Bijvoorbeeld, de voice-software maakt het mogelijk om geluiden die handmatig waren geselecteerd voor de afwezigheid van ruis 32 te analyseren. In deze software, de winning van de akoestische variabelen is automatisch, maar moet de eerste handmatige selectie.

Opgemerkt wordt dat de inter-individuele variabiliteit is zeer belangrijk in de vocale gedrag van muizen. Zo wordt de oproep snelheid van volwassen mannen in aanwezigheid van een oestrus vrouwelijke zeer verdeeld (figuur 1). we suggest deze gestandaardiseerde protocollen aan ultrasone geluiden lokken reeds aan de variabiliteit in verband met de experimentele context te beperken. Toch willen we wijzen op het belang van de presentatie niet alleen het gemiddelde en SEM voor de gegevens, maar het belangrijkste is de afzonderlijke punten in monsters van kleine omvang 33. Het is ook zeer relevant - zo niet nodig - tenminste 12 individuen per groep / genotype opnemen representatieve gegevens te verzamelen. In veel gevallen moet de inter-individuele variabiliteit niet worden verborgen (meestal kan het niet), en het zou van groot belang zijn voor individuen die de genetische mutatie onderzocht, maar niet weergegeven geen atypisch fenotype te identificeren. Zulke mensen kunnen aanwijzingen over compensaties, die nieuwe wegen zou kunnen openen voor therapieën van genetische stoornissen.

In de meeste gedragsproblemen karakteriseringen van muismodellen voor neuropsychiatrische aandoeningen, vocale gedrag en sociale contacten te overwegened elkaar (bijvoorbeeld 19,27,34,35). Recente analyse methoden leveren nu een semi-automatische gedetailleerde karakterisering van de sociale gebeurtenissen en reeksen gebeurtenissen tijdens een interactie (met MiceProfiler bijvoorbeeld) 36, evenals de mogelijkheid om deze analyse met gegevens van geluidsopnamen combineren. Het belangrijkste voordeel van deze methode is om een ​​volledig beeld van de sociale communicatie in muismodellen van ASD, om nauwkeuriger te bepalen welke aspecten van sociale communicatie worden beïnvloed. In dit protocol de synchronisatie nog handmatig, maar dit kan worden verbeterd door het activeren van de video-opname door de geluidsopnametoepassing. Dit soort analyses moet de norm naar een meer uitgebreid overzicht van de tekorten sociale communicatie in muismodellen van neuropsychiatrische stoornissen geworden. Bovendien tot nu vocale signalen worden meestal geanalyseerd vanuit het emitter zijde (bijv tests worden gebouwd om de emissie van vo bevorderencal signalen van de geteste muizen, zoals in de onderhavige protocollen). De nadruk moet nu ook instelbaar op de ontvanger van deze signalen, de functies van deze akoestische signalen beter te identificeren. Dit moet gebeuren door de beoordeling ook het gedrag van de nieuwkomer muizen in de onderhavige protocollen bij volwassenen (met MiceProfiler bijvoorbeeld) 36, met weergave experimenten 16 of door nieuwe protocollen. Inderdaad, de huidige protocollen voorzien zeer constrained situaties die misschien niet de exacte ethologisch voorwaarden emissie vocalisatie bij muizen. De spontane emissie van ultrasone geluiden moeten worden beter gekarakteriseerd met behulp van continue audio- en video-opnamen om meer licht te werpen op de spontane vocale gedrag van de muizen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

This work was supported by the Fondation de France; by the ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; by the ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; by Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); by the Fondation Orange; by the Fondation FondaMentale; by the Fondation de France; by the Fondation Bettencourt-Schueller. The research leading to this article has also received support from the Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking under grant agreement no. 115300, resources of which are composed of financial contribution from the European Union's Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and EFPIA companies' in kind contribution. We thank Julie Lévi-Strauss for helpful comments on the manuscript and six anonymous reviewers whose comments noticeably improved the manuscript.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
needles 0.3mm x 13 mm [30 G 1/2"]BD Microlance304000-
green tattoo pasteKetchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada329AA-
thermometerFisherbrand, Waltham, USA4126 (W255NA)-
self-made soundproof chamber (pups)Institut Pasteur, Paris-acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 cm x 33 cm x 32 cm
small surface thermister + single probe thermocoupleHarvard Apparatus599814 + 601956-
smell-less penfor instance: Giotto-ink made with water, washable: these pens are designed for babies
Ethanol absolute (100%)Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, France24103diluted 1/10
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPAAvisoft Bioacoustics, Berlin, Germany#40011furnished with extension cables by the Avisoft company
Ultrasound Gate 416HAvisoft Bioacoustics, Berlin, Germany#34163sound card
Avisoft Recorder USGHAvisoft Bioacoustics, Berlin, Germany#10301; #10302recording software for Windows Vista, 7 and 8
Avisoft SASLab ProAvisoft Bioacoustics, Berlin, Germany#10101, 10111; #10102, 10112; Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software.
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp--running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints
plastic recipient (pup recordings)Lock & Lock, Chatswood, USAHPL932DLock & Lock Stackable Airtight Container Round 700 ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height
PBS 1x (pH = 7.4)Gibco (Life Technologies)10010-023-
slidesMenzel-Gläser, Thermo ScientificJ1800AMNZSuperfrost Plus
May-Grünwald solution 500 mlRAL Réactifs, Martillac, France320070-0500-
Giemsa R 500 mlRAL Réactifs, Martillac, France720-1107diluted 1/20 in phosphate buffer solution
phosphate buffer solution (self-made)--pH = 7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml)
test cageInstitut Pasteur, Paris-50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas
self-made soundproof chamber (adult recordings)Institut Pasteur, Paris-acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 cm x 90 cm x 46 cm
video cameraFrom Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands-high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps 
EthoVision XTNoldus Information Technology, Wageningen, The Netherlandshttp://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xtvideo acquisition software
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platformBio Image Analysis, Institut Pasteur, Parishttp://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Trackertracking software to analyse behavioral events during social interactions

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition (DSM-V). , (2013).">American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition (DSM-V). , (2013).
  2. Behavioral Profiles of Mouse Models for Autism Spectrum Disorders. Autism Res. 4 (1), 5-16 (2011).">Ey, E., Leblond, C. S., Bourgeron, T. Behavioral Profiles of Mouse Models for Autism Spectrum Disorders. Autism Res. 4 (1), 5-16 (2011).
  3. Contemporary Clinical Neuroscience: Transgenic and Knockout Models of Neuropsychiatric Disorders. , 151-174 (2006).">Bourgeron, T., Jamain, S., Granon, S. Animal Models of Autism - Proposed Behavioral Paradigms and Biological Studies. Contemporary Clinical Neuroscience: Transgenic and Knockout Models of Neuropsychiatric Disorders. , 151-174 (2006).
  4. Ultrasonic vocalizations: A tool for behavioural phenotyping of mouse models of neurodevelopmental disorders. Neurosci. Biobehav. Rev. 33 (4), 508-515 (2009).">Scattoni, M. L., Crawley, J., Ricceri, L. Ultrasonic vocalizations: A tool for behavioural phenotyping of mouse models of neurodevelopmental disorders. Neurosci. Biobehav. Rev. 33 (4), 508-515 (2009).
  5. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Cur. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).">Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Cur. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
  6. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PLOS ONE. 7, e46610(2012).">Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PLOS ONE. 7, e46610(2012).
  7. A humanized version of Foxp2 does not affect ultrasonic vocalization in adult mice: Ultrasonic vocalization of "humanized" FoxP2 mice. Genes Brain Behav. , (2015).">Hammerschmidt, K., Schreiweis, C., Minge, C., Pääbo, S., Fischer, J., Enard, W. A humanized version of Foxp2 does not affect ultrasonic vocalization in adult mice: Ultrasonic vocalization of "humanized" FoxP2 mice. Genes Brain Behav. , (2015).
  8. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 28-34 (2007).">Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 28-34 (2007).
  9. Affiliative Behavior, Ultrasonic Communication and Social Reward Are Influenced by Genetic Variation in Adolescent Mice. PLOS ONE. 2, (2007).">Panksepp, J. B., et al. Affiliative Behavior, Ultrasonic Communication and Social Reward Are Influenced by Genetic Variation in Adolescent Mice. PLOS ONE. 2, (2007).
  10. Ultraschall-Laute bei jungen Mäusen. Naturwissenschaften. 43, 502(1956).">Zippelius, H. -M., Schleidt, W. M. Ultraschall-Laute bei jungen Mäusen. Naturwissenschaften. 43, 502(1956).
  11. Ultrasonic emissions: do they facilitate courtship of mice. J. Comp. Physiol. Psychol. 84, 445-452 (1973).">Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. Ultrasonic emissions: do they facilitate courtship of mice. J. Comp. Physiol. Psychol. 84, 445-452 (1973).
  12. Ultrasonic songs of male mice. PLOS Biol. 3, 2177-2186 (2005).">Holy, T. E., Guo, Z. S. Ultrasonic songs of male mice. PLOS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
  13. Ultrasonic vocalizing by adult female mice (Mus musculus). J. Comp. Psychol. 99, 420-436 (1985).">Maggio, J. C., Whitney, G. Ultrasonic vocalizing by adult female mice (Mus musculus). J. Comp. Psychol. 99, 420-436 (1985).
  14. Adult Male Mice Emit Context-Specific Ultrasonic Vocalizations That Are Modulated by Prior Isolation or Group Rearing Environment. PLOS ONE. 7 (1), e29401(2012).">Chabout, J., et al. Adult Male Mice Emit Context-Specific Ultrasonic Vocalizations That Are Modulated by Prior Isolation or Group Rearing Environment. PLOS ONE. 7 (1), e29401(2012).
  15. Female mice respond to male ultrasonic "songs" with approach behaviour. Biol. Lett. 5, 589-592 (2009).">Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic "songs" with approach behaviour. Biol. Lett. 5, 589-592 (2009).
  16. Lack of social exploratory activation in male -opioid receptor KO mice in response to playback of female ultrasonic vocalizations. Soc. Neurosci. 6, 76-87 (2011).">Wöhr, M., Moles, A., Schwarting, R. K. W., D'Amato, F. R. Lack of social exploratory activation in male -opioid receptor KO mice in response to playback of female ultrasonic vocalizations. Soc. Neurosci. 6, 76-87 (2011).
  17. Executive and social behaviors under nicotinic receptor regulation. Proc. Nat. Acad. Sci. 100 (16), 9596-9601 (2003).">Granon, S., Faure, P., Changeux, J. -P. Executive and social behaviors under nicotinic receptor regulation. Proc. Nat. Acad. Sci. 100 (16), 9596-9601 (2003).
  18. Autistic-like behaviours and hyperactivity in mice lacking ProSAP1/Shank2. Nature. 486 (7402), 256-260 (2012).">Schmeisser, M. J., et al. Autistic-like behaviours and hyperactivity in mice lacking ProSAP1/Shank2. Nature. 486 (7402), 256-260 (2012).
  19. Absence of Deficits in Social Behaviors and Ultrasonic Vocalizations in Later Generations of Mice Lacking Neuroligin4. Genes Brain Behav. 11, 928-941 (2012).">Ey, E., et al. Absence of Deficits in Social Behaviors and Ultrasonic Vocalizations in Later Generations of Mice Lacking Neuroligin4. Genes Brain Behav. 11, 928-941 (2012).
  20. Minimal Aberrant Behavioral Phenotypes of Neuroligin-3 R451C Knockin Mice. Autism Res. 1, 147-158 (2008).">Chadman, K. K., et al. Minimal Aberrant Behavioral Phenotypes of Neuroligin-3 R451C Knockin Mice. Autism Res. 1, 147-158 (2008).
  21. Unusual Repertoire of Vocalizations in the BTBR T plus tf/J Mouse Model of Autism. PLOS ONE. 3, (2008).">Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual Repertoire of Vocalizations in the BTBR T plus tf/J Mouse Model of Autism. PLOS ONE. 3, (2008).
  22. Computerized video analysis of social interactions in mice. Nat. Methods. 9, 410-417 (2012).">De Chaumont, F., Coura, R. D. -S., et al. Computerized video analysis of social interactions in mice. Nat. Methods. 9, 410-417 (2012).
  23. Genetic and Functional Analyses of SHANK2 Mutations Suggest a Multiple Hit Model of Autism Spectrum Disorders. PLOS Genet. 8 (2), e1002521(2012).">Leblond, C. S., et al. Genetic and Functional Analyses of SHANK2 Mutations Suggest a Multiple Hit Model of Autism Spectrum Disorders. PLOS Genet. 8 (2), e1002521(2012).
  24. Mutations in the SHANK2 synaptic scaffolding gene in autism spectrum disorder and mental retardation. Nat. Genet. 42, 489-491 (2010).">Berkel, S., et al. Mutations in the SHANK2 synaptic scaffolding gene in autism spectrum disorder and mental retardation. Nat. Genet. 42, 489-491 (2010).
  25. Functional impact of global rare copy number variation in autism spectrum disorders. Nature. 466, 368-372 (2010).">Pinto, D., et al. Functional impact of global rare copy number variation in autism spectrum disorders. Nature. 466, 368-372 (2010).
  26. The autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).">Ey, E., et al. The autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
  27. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T plus tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10, 44-56 (2010).">Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T plus tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10, 44-56 (2010).
  28. Multiparous species present problems (and possibilities) to developmentalists. Dev. Psychobiol. 30 (2), 141-150 (1997).">Zorrilla, E. P. Multiparous species present problems (and possibilities) to developmentalists. Dev. Psychobiol. 30 (2), 141-150 (1997).
  29. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14 (1), 37(2013).">Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14 (1), 37(2013).
  30. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. Behav. 96, 602-605 (2009).">Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. Behav. 96, 602-605 (2009).
  31. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).">Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. R. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
  32. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Sci. Rep. 5, 10237(2015).">Burkett, Z. D., Day, N. F., Peñagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Sci. Rep. 5, 10237(2015).
  33. Beyond Bar and Line Graphs: Time for a New Data Presentation Paradigm. PLOS Biol. 13 (4), e1002128(2015).">Weissgerber, T. L., Milic, N. M., Winham, S. J., Garovic, V. D. Beyond Bar and Line Graphs: Time for a New Data Presentation Paradigm. PLOS Biol. 13 (4), e1002128(2015).
  34. Reduced social interaction and ultrasonic communication in a mouse model of monogenic heritable autism. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 105, 1710-1715 (2008).">Jamain, S., et al. Reduced social interaction and ultrasonic communication in a mouse model of monogenic heritable autism. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 105, 1710-1715 (2008).
  35. Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function. Nature. 486, 261-265 (2012).">Won, H., et al. Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function. Nature. 486, 261-265 (2012).
  36. Social Communication in Mice - Are There Optimal Cage Conditions? PLOS ONE. 10 (3), e0121802(2015).">Ferhat, A. -T., Le Sourd, A. -M., de Chaumont, F., Olivo-Marin, J. -C., Bourgeron, T., Ey, E. Social Communication in Mice - Are There Optimal Cage Conditions? PLOS ONE. 10 (3), e0121802(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ultrasonic VocalizationsMouse ModelsSocial CommunicationAutism Spectrum DisordersShank2 GeneSoundproof BoxCondenser Ultrasound MicrophonemouseTube DatabasePup Isolation CallsAdult Male Female Interactions

Related Articles