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Uso de olhos de coelhos em farmacocinéticas Estudos de intraoculares Drogas

Published: July 23, 2016
doi:
10.3791/53878
, , , , , , , ,
1Department of Ophthalmology,Seoul National University Bundang Hospital, 2Department of Ophthalmology, College of Medicine,Seoul National University, 3Department of Ophthalmology,Hanyang University Hospital, 4Department of Ophthalmology,Seoul Metropolitan Government-Seoul National University Boramae Medical Center, 5Department of Clinical Pharmacology,Seoul National University Hospital, 6Department of Clinical Pharmacology,Seoul National University Bundang Hospital

Summary

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

Abstract

A via intra-ocular de administração da droga permite a entrega de concentrações elevadas de drogas terapêuticas, enquanto minimiza a sua absorção sistémica. Vários fármacos são administrados dentro da câmara anterior ou vítrea, e a injecção intra-ocular tem sido eficaz na cura de várias doenças intra-oculares. Coelho olhos têm sido amplamente utilizadas para a investigação oftálmica, tal como o animal é fácil de manusear e económica em comparação com outros mamíferos, e o tamanho do olho de coelho é semelhante ao de um olho humano. Usando uma agulha G 30, a droga pode ser injectado para dentro dos espaços intracamerais e intravítrea de olhos de coelho. Os globos oculares são então congeladas até à análise e pode ser dividido em humor aquoso e do humor vítreo e retina / coróide. As amostras vítreas e na retina / coróide pode ser homogeneizada e solubilizado antes da análise. Em seguida, os imunoensaios podem ser realizados para medir as concentrações de droga intra-ocular em cada compartimento. modelos farmacocinéticos apropriados podem serutilizado para calcular vários parâmetros, tais como a meia-vida e a concentração máxima da droga. Coelho olhos pode ser um bom modelo para estudos de farmacocinética dos medicamentos intra-oculares.

Introduction

Antes do advento de entrega intra-ocular de droga, a principal preocupação de terapia médica para doenças intra-oculares foi a eficiência com a qual o fármaco pode penetrar no interior do olho. A barreira hemato-ocular impede muitas substâncias, incluindo drogas, de difundir para dentro do olho. Portanto, as concentrações dos fármacos que são acima dos níveis terapêuticos pode não ser facilmente obtido. O método de administração de droga intra-ocular, incluindo injecções intravítreas e intracamerais, é possível ignorar directamente a barreira hemato-ocular 1-3, de modo que concentrações terapêuticas de drogas pode ser conseguida no olho 4,5.

Por conseguinte, a entrega de drogas intravítreas tornou-se um método popular de tratamento para várias doenças intra-oculares 5,6. Por exemplo, injecção intravítrea é amplamente realizada para a degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, oclusão venosa retiniana, e infecções intra-oculares 7-10. Em particular, uma veza introdução de medicamentos anti-VEGF, a frequência das injecções intravítreas foi notavelmente aumentada para o tratamento de doenças da retina. Portanto, é importante compreender a farmacocinética intraoculares de tais drogas para avaliar a eficácia e segurança da terapia médica.

Embora a administração intra-ocular de drogas é considerado um grande avanço na terapia médica para doenças oculares, o monitoramento da concentração da droga dentro do globo ocular é tecnicamente exigente. Uma vez que os olhos humanos contêm apenas pequenas quantidades de humor aquoso (cerca de 200 uL) e vidro (cerca de 4,5 ml, Tabela 1), é tecnicamente difícil obter uma quantidade suficiente de fluido ocular para medir a concentração da droga. Além disso, os métodos que são usados ​​para se obter o líquido do olho, como bater vítreo ou paracentese da câmara anterior, podem danificar o tecido ocular e resultar em complicações graves, tais como cataratas, endoftalmite, oudescolamento de retina 11,12. Por conseguinte, os modelos animais são utilizados em estudos farmacocinéticos de fármacos comumente utilizados intraoculares 13. Entre estes modelos animais, coelhos ou macacos são os animais mais frequentemente utilizados.

Coelhos, que são pequenos mamíferos da ordem Lagomorpha na família dos leporídeos, são encontrados em várias partes do mundo. Porque os coelhos não são agressivos, eles são fáceis de manusear, usar em um experimento, e observar. Baixo custo, disponibilidade imediata do animal, de tamanho semelhante ao olho humano, e uma grande base de dados de informação para a comparação favorável realizar estudos farmacocinéticos usando olhos de coelhos. Neste trabalho, um protocolo para estudos de farmacocinética dos medicamentos intra-ocular em olhos de coelhos é descrito.

Protocol

Nosso protocolo segue as diretrizes da Atenção Institucional Animal e Uso Committee (IACUC) de Seul Bundang Hospital da Universidade Nacional, que aprovou todos os procedimentos com animais e métodos de cuidados de animais apresentados neste protocolo. O IACUC está em plena conformidade com a oitava edição do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (2011). Todos os procedimentos foram realizados com a adesão às diretrizes da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de An…

Representative Results

O processo que é usado para realizar injecções intravítreas de uma droga de interesse em olhos de coelhos com técnicas estéreis é mostrado na Figura 1. Os olhos são enucleados tratados em uma hora programada e armazenado a -80 ° C. Para a análise, três compartimentos, o humor aquoso, o vítreo e a retina / coróide, são separados a partir dos olhos de coelhos congelados, como demonstrado na Figura 2. As amostras dos compartimentos são prepar…

Discussion

With the increasing use of intraocular drugs, such as anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) agents, for the treatment of diverse ocular diseases, knowledge of the tissue distribution and clearance of the drug after the intraocular injection is important. Understanding the pharmacokinetics of intraocular drugs is important for understanding the efficacy and safety of drugs, determining the optimal dosage of the drugs, and minimizing systemic or intraocular complications. However, detailed pharmacokinetic studies …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Ms. Ji Hyun Park and Ji Yeon Park for their technical assistance in the animal experiments. This work was supported by a grant from the Seoul National University Bundang Hospital Research Fund (grant number: Grant No. 14-2014-022) and from a grant (CCP-13-02-KIST) from the Convergence Commercialization Project of the National Research Council of Science and Technology, Seoul, Korea.

Materials

Zoletil Virbac Laboratories, Carros Cedex, France
Xylazine hydrochloride  Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA
Proparacaine hydrochloride (Alcaine) Alcon laboratories, Fort Worth, TX
Phenylephrine hydrochloride and tropicamide Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan
Recombinant Human VEGF 165 R&D systems 293-VE-050
Carbobate-Bicarbonate buffer SIGMA C3041-50CAP
NUNC MICROWELL 96F                                                               W/LID NUNCLON D SI                                                                          Thermo SCIENTIFIC 167008 96 well plate
Bovine Serum Albumin (BSA) 25grams(Net) BOVOGEN BSA025
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH7.4 (1X), 500mL gibco 10010-023
Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo SCIENTIFIC PA1-28652
Goat Anti-Human IgG Fc(HRP) abcam ab97225
Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo SCIENTIFIC PA1-85183
CelLytic MT  Cell Lysis Reagent SIGMA C3228-50ML lysis buffer
100 Scalpel Blades nopa instruments BLADE #15
100 Scalpel Blades nopa instruments BLADE #10
FEATHER SURGICAL BLADE STAINLESS STEEL FEATHER 11
1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250mL Thermo SCIENTIFIC 34018
Stable Peroxide Substrate Buffer (10X), 100mL Thermo SCIENTIFIC 34062
Softmax Pro Molecular Devices v.5.4.1 software for generating standard curve
SAAM II  Saam Institute, Seattle, WA software for pharmacokinetic modeling
Phoenix WinNonlin Pharsight, Cary, NC v. 6.3 software for pharmacokinetic modeling
Avastin (bevacizumab) Genentech
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Ahn, S. J., Hong, H. K., Na, Y. M., Park, S. J., Ahn, J., Oh, J., Chung, J. Y., Park, K. H., Woo, S. J. Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs. J. Vis. Exp. (113), e53878, doi:10.3791/53878 (2016).
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