Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.
Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.
Ett grundläggande mål för regenerativ medicin är generering av nya, funktionella celler som kan användas för att reparera eller ersätta skadad, urartade vävnader. Omarbeta lätt tillgängliga vuxna celler in i nya, genom att omvandla dem från en celltyp till en annan, är ett särskilt tilltalande tillvägagångssätt, speciellt när den erforderliga cellpopulationen inte är rikligt förekommande eller svåra att komma åt. Emellertid vuxna celler är anmärkningsvärt stabila. De får sin differentierat tillstånd genom en gradvis begränsning i deras alternativ och när de når mogen terminal specialisering, de stabilt behålla det en.
Under de senaste åren har ett antal protokoll har utvecklats, som gör det möjligt för omprogrammering till pluripotens av en somatisk cell (iPS) uppnås genom tvångs uttryck för en uppsättning av transkriptionsfaktorer 2,3. Alternativt kan cell omvandlingen erhållas genom direkt härstamning transdifferentiering, att införa en enda 4 </sup> eller en kombination av transkriptionsfaktorer 5-7. Denna strategi innebär inte övergången genom en de-differentierade tillstånd men kräver hög expression av specifika transkriptionsfaktorer 8.
Vi har nyligen utvecklat en omvandlingsprotokoll baserat på kortvarig exponering av vuxna celler till demetylering egenskaperna för cytidin-analog 5-azacytidin (5-aza-CR), en välkarakteriserad DNA-metyltransferas-inhibitor. Den demetylering steg följs omedelbart av en specifik differentiering protokoll 9-11 som gör det möjligt att erhålla den erforderliga terminal fenotypen. Denna metod är i stånd att omvandla mogna, differentierade celler i celler av en annan härstamning och har den väsentliga fördelen att undvika både användningen av virala vektorer och transfektion av eventuella exogena transkriptionsfaktorer. Förvärvet av en stabil pluripotent tillstånd och relaterade ökad mottaglighet för cell instabilitet undviks också.
<p class="Jove_content"> Den detaljerade protokoll som möjliggör omvandlingen av vuxna humana hudfibroblaster i fullt fungerande insulinfrisättande cellerna presenteras här. Det är dock värt att notera att tekniken har tillämpats på olika celltyper och har genererat positiva resultat, när man hanterar celler mot olika differentieringsvägar. Dessutom har epigenetiska omvandling använts framgångsrikt i den mänskliga och svin 9-13 liksom hos hund (manuskript inlämnat) tyder på en bred effekt och robusthet av tillvägagångssättet.Föreliggande manuskript beskriver en metod som möjliggör omvandling av humana hudfibroblaster i insulinproducerande celler, genom en övergående och kort exponering för 5-aza-CR, följt av en vävnadsspecifik induktionsprotokollet. Detta tillvägagångssätt gör en övergång från mesoderm till endoderm relaterade celler, utan tvångs uttryck av transkriptionsfaktorer eller mikroRNA eller förvärvet av en stabil pluripotent tillstånd, som gör cellerna mer instabila och benägna att misstag 14.
<…The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av Carraresi Foundation och Europeiska fonden för studien av sockersjuka (EFSD). GP stöds av en post-doc stipendium från universitetet i Milano. Författarna är medlemmar i COST Action FA1201 Epiconcept: Epigenetik och Periconception miljön och COST Action BM1308 Sharing förskott på stora djurmodeller (Salaam). TALB är medlem i COST Action CM1406 Epigenetisk Chemical Biology (EPICHEM).
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
100 mm petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
35 mm petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1µg/ml |
5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |