JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

نموذج الفئران من المعوية الإسكيمية-ضخه إصابة

Published: May 11, 2016
doi:
10.3791/53881
, , , ,
1Trudeau Institute, 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, 3Departments of Medicine and Infectious Diseases and Pathology,University of Florida

Summary

نحن هنا وصف الإجراء مفصل من الأمعاء نقص التروية ضخه في الفئران مما يؤدي إلى الإصابة استنساخه دون وفيات لتشجيع توحيد هذه التقنية عبر الميدان. ويمكن استخدام هذا النموذج من الأمعاء إصابة نقص التروية ضخه لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للإصابة والتجدد.

Abstract

نقص تروية الأمعاء هو حالة تهدد الحياة المرتبطة مع مجموعة واسعة من الحالات الطبية بما في ذلك تصلب الشرايين والجلطة، انخفاض ضغط الدم، التهاب الأمعاء الناخر، زرع الأمعاء، والصدمات النفسية والالتهابات المزمنة. المعوية إصابة نقص التروية ضخه (الأشعة تحت الحمراء) هي نتيجة لنقص التروية المساريقي الحاد، والناجمة عن عدم كفاية تدفق الدم من خلال الأوعية المساريقي، مما أدى إلى تلف الأمعاء. يمكن ضخه نقص التروية التالية يزيد من تفاقم الضرر من الأمعاء. آليات إصابة الأشعة تحت الحمراء معقدة وغير مفهومة. ولذلك، نماذج حيوانية صغيرة تجريبية حاسمة لفهم الفيزيولوجيا المرضية لإصابة الأشعة تحت الحمراء وتطوير علاجات جديدة.

نحن هنا وصف نموذج الفأر من الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية الحادة التي توفر اصابة استنساخه من الأمعاء الدقيقة دون وفيات. ويتحقق ذلك عن طريق إحداث نقص التروية في منطقة الدقاق القاصي قبل زمنيا occludinز الفروع الجانبية المحيطية والطرفية من الشريان المساريقي العلوي لمدة 60 دقيقة باستخدام مقاطع الاوعية الدموية الدقيقة. ضخه لمدة 1 ساعة، أو 2 ساعة بعد النتائج إصابة في إصابة استنساخه من الأمعاء فحص عن طريق التحليل النسيجي. الموقف الصحيح من لقطات الاوعية الدموية الدقيقة هو أمر حاسم لهذا الإجراء. وبالتالي يوفر مقطع الفيديو المرئي وصف تفصيلي خطوة بخطوة من هذه التقنية. ويمكن استخدام هذا النموذج من الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للإصابة والتجدد.

Introduction

الأمعاء حساس جدا لانقطاع تدفق الدم الذي يسبب نقص التروية والظهارية الضرر. ضخه بعد نقص التروية توفر إعادة الأوكسجين للأنسجة، ويمكن أن تزيد من تعزيز علم الأمراض. لذلك، يرتبط المعوية إصابة نقص التروية وضخه مع مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك التهاب الأمعاء الناخر، رفض المزروع في زرع الأمعاء الدقيقة، والمضاعفات من البطن جراحة الشريان الأبهر تمدد الأوعية الدموية، المجازة القلبية الرئوية، والتهاب 1،2 أمراض الأمعاء. المعوية الأشعة تحت الحمراء الإصابة، الجلطة المعوية خاصة الحاد، هو حالة تهدد الحياة مما أدى إلى معدلات الاعتلال والوفيات 3.

على الرغم من أن يساء فهمها، ويعتقد الأمعاء نقص التروية ضخه (IR) إصابة تترافق مع تغيرات في مجهريات الأمعاء وكذلك إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية والسيتوكينات الالتهابية وكيموكينات 1،4-6. وهذا يؤدي إلى تنشيط سواء فينيت والآليات المناعية التكيفية التي تعزز الالتهابات والأنسجة إصابة 1،7،8.

النماذج الحيوانية حاسمة لفهم آليات الإصابة الأشعة تحت الحمراء، كما أنها تسمح gain- سهلة والتجارب الجينية الخسارة من وظيفة. وقد وضعت عدة نماذج حيوانية من الأشعة تحت الحمراء التي تشمل انسداد الأوعية الدموية كاملة، وانخفاض التروية التدفق، ومجزأة انسداد الأوعية الدموية (تلخيصها في مراجعة شاملة جرت مؤخرا 9). نقص تروية الأمعاء الناجمة عن انسداد الأوعية الدموية كاملة من الشريان المساريقي (SMA) هو نموذج سهل ويشيع استخدامها من الأشعة تحت الحمراء في الحيوانات الكبيرة والقوارض 9-11. ومع ذلك، ومناطق مختلفة من الأمعاء لها وضعية مختلفة للإصابة. وبالإضافة إلى ذلك، ومجموعة متنوعة من التخدير، والمسكنات، وتقنيات انسداد الشريان، فضلا عن التضارب في مدة الإصابة الدماغية ونتيجة التعافي في درجات متفاوتة من الإصابة التباس فهمنا للبيولوجيا الأشعة تحت الحمراء عبر الى الدراسات متعددةالصورة. يوضح الجدول 1 هذه التناقضات في دراسات الأشعة تحت الحمراء الفئران. العائق الاكبر من استخدام مرات الدماغية أقصر (30-45 دقيقة) تستهدف نافذة الانتعاش التي تقوم عليها الخلافات تمييز بين الحالات والضوابط يمكن ملاحظتها. إصابة خفيفة لظهارة يمكن حل ساعة بعد ضخه، وبالتالي متخصصة قد تكون هناك حاجة المقاييس المرضية للعثور على الخلافات في الرد الظهارية. في المقابل، الضرر المفرط، كما رأينا من قبل 100 دقيقة من الإصابة الدماغية قد يؤدي إلى denudement كاملة من الظهارة، حيث رد لم يعد ممكنا، وزيادة معدل وفيات، والوقت الانتعاش. ولذلك، ونحن هنا وصف الإجراء مفصل من الأشعة تحت الحمراء المعوية في الفئران مما يؤدي إلى الإصابة استنساخه دون وفيات لتشجيع توحيد هذه التقنية عبر مجالنا. ويمكن استخدام هذا النموذج من الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للإصابة والتجدد.

Protocol

أجريت الدراسات على الحيوانات وفقا للمعهد الوطني للإرشادات الصحة وتمت الموافقة من قبل رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام جنة معهد ترودو. واستخدمت الأسبوع 8-12 القديمة C57BL / 6 الفئران للدراسة. 1. التحضير للجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"…

Representative Results

نحن الأمثل بروتوكول تجريبي لجراحة الأشعة تحت الحمراء للحصول على استنساخه إصابة الأشعة تحت الحمراء التي يسببها للالدقاق في الفئران. وأظهرت نتائج ممثلة في هذا القسم. ويبين الشكل 1 أمثل?…

Discussion

تطوير نماذج الماوس الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية قد تحسنت بشكل كبير في فهم آليات إصابة الأنسجة وساعد في تطوير الاستراتيجيات العلاجية المحتملة للحد من تلف الأنسجة 7،9،11،34. الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول هي تحديد المواقع المناسبة لقطات الاوعية الدموية ال…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وبدعم من مؤسسة العلوم الروسية هذا العمل، منح لا. 14-50-00060 وLLC RUSCHEMBIO. وأيد هذا العمل أيضا من قبل مؤسسة Crohn`s والتهاب القولون الأمريكية منح 294083 (لAVT)، والمعاهد الوطنية للصحة منح RO1 DK47700 (إلى CJ).

Materials

Heated Pad Sunbeam E12107-819 Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine Vasco UCAP 0001-0000171 Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone Parkland Scientific ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge Parkland Scientific 80000, 80120
Induction Chamber Surgivet V711802
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-10 Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper  Oster  Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment Webster 8804604
Buprenorphine McKesson 562766 Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl) Pfizer NADA 45-290 Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips Puritan medical products 806-WC Autoclave before use
Betadine Purdue Products 67618-150-17 10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution Aspen 46066-807-60 Adjust to room temperature before use
Sterile cotton gauze pad Fisher Healthcare 22-415-468
Non-adherent pad prepack Telfa 1238
IR rodent thermometer BIOSEB BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70g Roboz Surgical  RS5424, RS5435 Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40g Roboz Surgical  RS6472 Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps World Precision Instruments 14189 Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin Thermo Scientific 14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm Cell Point Scientific 201-1000
Autoclip applier Beckton Dickinson 427630
Byopsy foam pad Simport M476-1
Tissue cassette Fisher Healthcare 15182701A Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin Fisher Scientific 245-684
Surgical iris scissors World Precision Instruments 501263-G SC Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors World Precision Instruments 501219-G Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps Roboz Surgical  RS-5228, RS-8122 Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50mg Sigma 2106
Reflex wound clip removing forceps Roboz Surgical  RS-9263 Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice  Jackson Laboratory Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3×4, sterile Coviden 1050
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
  2. Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).
  3. Yasuhara, H. Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology. Surg Today. 35, 185-195 (2005).
  4. Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling. Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).
  5. Lee, H., et al. Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury. Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).
  6. Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).
  7. Wu, M. C., et al. The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).
  8. Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status. Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).
  9. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).
  10. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49, 168-173 (1990).
  11. Goldsmith, J. R., et al. Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling. Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).
  12. Cuzzocrea, S., et al. Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut. Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).
  13. Farber, A., et al. A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice. J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).
  14. Ben, D. F., et al. TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 174, 326-333 (2012).
  15. Watson, M. J., et al. Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs. Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).
  16. Watanabe, T., et al. Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).
  17. Murayama, T., et al. JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine. Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).
  18. Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107, 574-580 (1990).
  19. Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).
  20. Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model. Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).
  21. Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).
  22. Fleming, S. D., et al. Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice. J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).
  23. Fleming, S. D., et al. Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire. J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).
  24. Lapchak, P. H., et al. Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).
  25. Rehrig, S., et al. Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice. J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).
  26. Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion. Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).
  27. Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage. J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).
  28. Feinman, R., et al. HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).
  29. Lapchak, P. H., et al. The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury. PloS one. 7, e39934 (2012).
  30. Wen, S. H., et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation. Shock. 38, 411-419 (2012).
  31. Wang, F., et al. Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion. Shock. 39, 96-103 (2013).
  32. Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).
  33. Hassoun, H. T., et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).
  34. Stallion, A., et al. Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation. J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).
  35. Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia?. Surgery. 121, 526-534 (1997).
  36. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
  37. Victoni, T., et al. Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway. Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).
  38. Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PloS one. 9, e110441 (2014).
  39. Pope, M. R., Fleming, S. D. TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation. J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).
  40. Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E., Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).
  41. Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg. 101, 478-483 (1970).
  42. Quaedackers, J. S., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).
  43. Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine. Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).
  44. Yandza, T., et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. J Surg Res. 178, 807-819 (2012).

Tags

Murine ModelIntestinal Ischemia-reperfusion InjurySuperior Mesenteric ArteryMicrovascular ClipsLaparotomyCecumIleumReperfusion
check_url/53881?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (111), e53881, doi:10.3791/53881 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image