Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryo's: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring

Summary

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Abstract

De erwt Acyrthosiphon pisum, met een gefaseerde genoom en overvloedige fenotypische plasticiteit, is uitgegroeid tot een opkomende model voor genomische en ontwikkelingsstudies. Net als andere bladluizen, A. Pisum verspreiden zich snel via parthenogenetische levendbarende voortplanting, waar de embryo's ontwikkelen binnen ei kamers in een lopende band mode in de ovariole. Eerder hebben we een robuust platform van whole-mount in situ hybridisatie waardoor detectie van mRNA expressie in de bladluis embryo's vastgesteld. Voor het analyseren van de expressie van eiwitten, hoewel, vastgestelde protocollen voor immunokleuring de ovarioles van ongeslachtelijke levendbarende bladluizen leverde geen bevredigende resultaten te produceren. Hier melden wij voorwaarden geoptimaliseerd voor toenemende weefsel permeabiliteit en dalende achtergrond kleuring, die beide waren problemen bij het toepassen van gevestigde benaderingen. Optimalisaties omvatten: (1) incubatie van proteïnase K (1 ug / ml, 10 min) en bleek essentieel fof antilichaam penetratie in de midden- en late fase bladluis embryo's; (2) vervanging van normale geit serum / runderserumalbumine met een digoxigenine (DIG) toegevoerd blokkerend reagens gebaseerde buffer set en (3) de toepassing van methanol eerder waterstofperoxide (H ₂ O ₂₎ voor het bleken endogeen peroxidase; die aanzienlijk verminderde de achtergrondkleuring in de bladluis weefsels. Deze kritische omstandigheden geoptimaliseerd voor immunokleuring zal doeltreffende detectie van genproducten mogelijk maken in de embryo's van A. Pisum en andere bladluizen.

Introduction

Bladluizen zijn Hemipteran insecten met kleine (1-10 mm) zachte lichamen. Ze voeden zich met planten door zuigen phloem sap met piercing monddelen. Bovendien, ze vertrouwen op een obligaat endosymbiotic bacterie, Buchnera aphidicola, essentiële aminozuren die een tekort aan het floëem sap dieet te synthetiseren. Bladluizen hebben een complexe leven geschiedenis die parthenogenetische levendbarende voortplanting in het voorjaar en de zomer lange dag fotoperiodiciteit en seksuele ovipaar voortplanting veroorzaakt door korte-dag fotoperiodiciteit waarin zij lag een beperkt aantal overwinterende eieren ^1,2 omvat. In het voorjaar van deze eieren uitkomen van de eerste generatie van de all-female bladluizen (fundatrices) te produceren, na vele rondes van parthenogenetische voortplanting tot de herfst. De cyclische parthenogenese in bladluizen, waar de aseksuele en seksuele fasen wisselen elkaar af in de jaarlijkse levenscyclus, is beschouwd als een evolutionaire nieuwigheid ^1,2. In de parthenogenetische levendbarende bladluizen, Embryogenese plaatsvindt binnen ei kamers van de ovariële buisjes (ovarioles). Daarentegen seksuele oviparous embryo's ontwikkelen in de bevruchte eieren. Afgezien van reproductieve plasticiteit, kunnen bladluizen transgenerationele vleugel polyfenisme weer te geven: in reactie op overbevolking signalen en roofdier bedreigingen, kan het ongevleugelde aseksuele vrouwtjes levendbarende produceren gevleugelde nakomelingen voor migratie over lange afstand. Publicatie van de genoomsequentie van de erwt Acyrthosiphon pisum -het eerste genoom sequentie voor een basale hemimetabolous insect-maakt verdere verkenning van reproductieve plasticiteit, vleugel polyfenisme, en andere functies, waaronder insect-plant interacties, virale vectoring en symbiose in bladluizen op een moleculaire basis ^3.

Naast het genoom gesequenced, zijn hulpmiddelen voor het karakteriseren genexpressie en functie vereist voor het bevorderen van de erwtenbladluis als volwassen modelorganisme ^4. We hebben robuuste protocollen van de hele-mount beschreven <em> in situ hybridisatie voor het detecteren van expressie van mRNA in embryo bladluis ^5-7. RNA interferentie (RNAi) via dubbelstrengs RNA injectie en voeding is gebruikt voor silencing in bladluis nimfen en volwassenen, maar stabiele omstandigheden voor gentherapie knockdown in de embryo's nog niet gerapporteerd ^8-10. Immunokleuring, een antilichaam-gebaseerde aanpak die eiwitexpressie kan detecteren in monsters voor en na RNAi knock-down, is uitgevoerd op erwtenbladluis embryo ^11-13. Echter, verhoging van weefsel permeabiliteit en de eliminatie van de achtergrond vlekken zijn nog onvoldoende gebruik van standaard protocollen voor immunokleuring in de aseksuele levendbarende embryo's van erwtenbladluis. Zo vonden we dat penetratie van antilichaam aan het weefsel afgenomen gastrulating embryo (stadia 8-10) en embryo morfologisch identificeerbare ledematen (fasen 13-14) was nauwelijks permeabel voor antilichaam. Bovendien werd achtergrondkleuring gevisualiseerd in de aseksuele viviparoons erwtenbladluis embryo's gekleurd met behulp van antilichaam tegen het marker kiemlijn Vasa evenals die tegen Engrailed / Invected eiwit tot expressie gebracht in embryonale segmenten ^12,13. Eigenlijk achtergrondkleuring nog duidelijk zichtbaar in embryo's gekleurd met het secundaire antilichaam alleen.

Om de permeabiliteit verhogen zonder beschadiging van de integriteit van bladluis weefsels we zorgvuldig getitreerde de concentratie van proteinase K en bepaalde optimale omstandigheden voor weefsel digestie op bladluis embryo. Om niet-specifieke kleuring in de erwtenbladluis te vermijden, hebben we gezocht naar verbindingen die effectief embryo's kunnen blokkeren en onderdrukken de activiteit van endogene peroxidase (POD), een enzym gebruikt voor het versterken van signalen tijdens immunokleuring. Een blokkerende reagens geleverd door een digoxigenine (DIG) -gebaseerde bufferset plaats de traditioneel gebruikte normaal geitenserum (NGS) / bovine serum albumine (BSA), aanzienlijk verminderd achtergrondkleuring. Bovendien werd gevonden dat methanol inhibeet de endogene activiteit POD effectiever dan waterstofperoxide (H ₂ O _2). Details betreffende deze bladluis-specifieke voorwaarden voor immunokleuring op embryo's worden beschreven in de volgende paragrafen.

Protocol

1. Cultuur van bladluizen NB. Het laboratorium stam van de parthenogenetische levendbarende erwtenbladluis Een pisum werd oorspronkelijk verzameld in het centrum van Taiwan en is grootgebracht op waardplanten (de tuin erwt Pisum sativum of tuinboon Vicia faba) op basis van lange-dag fotoperiode voor meer dan 300 generaties (één generatie: ~ 10 dagen). Kieming van zaden Week de zaden van de waardplanten in leidingwater gedurende 3-5 dagen bij RT. Vullen me…

Representative Results

In deze studie hebben we uitgevoerd whole-mount immunokleuring op embryo's van aseksueel erwt bladluizen (Figuur 1A). Deze vrouwen produceren nakomelingen parthenogenetisch en levendbarende. Deze vrouwelijke embryo's ontwikkelen binnen ei kamers van de ovariële buisjes (ovarioles) (Figuur 1B en figuur 2A). Voordat microscopie, de ontleed ovarioles zijn de vlekken doelstellingen; echter gescheiden ei kamers verei…

Discussion

We identificeerden optimale omstandigheden van cruciaal belang voor een succesvolle immunokleuring in de erwtenbladluis A. Pisum, een opkomende modelorganisme voor genomische en ontwikkelingsstudies ^3,15. Geoptimaliseerde omstandigheden voor toenemende weefsel permeabiliteit en verminderen achtergrondkleuring verhoogde intensiteit en specificiteit van signalen. Zij verschillen van standaardprotocollen voor immunokleuring in andere dierlijke modellen in de stappen voor het creëren van porië…

Materials

30% hydrogen perxidase (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	1.1586E+10	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.