Identifikation af kritiske forhold for Immunfarvning i Ærten Bladlus embryoner: Stigende Tissue permeabilitet og aftagende baggrundsfarvning

Summary

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Abstract

Ærten bladlus Acyrthosiphon Pisum, med en sekventeret genom og rigelige fænotypisk plasticitet, er blevet en spirende model for genomiske og udviklingsmæssige undersøgelser. Ligesom andre bladlus, A. Pisum forplanter sig hurtigt via parthenogenetisk viviparous reproduktion, hvor embryonerne udvikle sig inden æg kamre i en forsamling-line mode i ovariole. Tidligere har vi etableret en solid platform af hel-mount in situ hybridisering muliggør påvisning af mRNA ekspression i bladlus embryoner. Til analyse af ekspressionen af ​​protein, selv om, etablerede protokoller til immunfarvning af ovarioles af ukønnede viviparous bladlus gav ikke tilfredsstillende resultater. Her rapporterer vi betingelser optimeret til at øge væv permeabilitet og faldende baggrund farvning, som begge var problemer, når de anvender etablerede tilgange. Optimeringer omfatter: (1) inkubation af proteinase K (1 ug / ml, 10 min), der blev fundet væsentlige feller antistof indtrængen i mellem- og sen-fase bladlus embryoner; (2) udskiftning af normalt gedeserum / bovint serumalbumin med en blokerende reagens leveret af en digoxigenin (DIG) -baseret buffer indstillet og (3) anvendelse af methanol i stedet hydrogenperoxid (H _{2 O 2)} til blegning endogen peroxidase; som reducerede signifikant baggrundsfarvning i bladlus væv. Disse kritiske forhold er optimeret til immunfarvning vil muliggøre en effektiv detektering af genprodukter i embryoner fra A. Pisum og andre bladlus.

Introduction

Bladlus er hemipteran insekter med små (1-10 mm) bløde organer. De lever af planter ved at suge Phloem saft med piercing munddele. Derudover de er afhængige af en obligat endosymbiotic bakterie, Buchnera aphidicola, at syntetisere essentielle aminosyrer, der er mangelfuld i den Phloem saft kost. Bladlus har en kompleks liv historie, der inkluderer parthenogenetisk viviparous reproduktion i løbet af foråret og sommeren lang dag fotoperioder og seksuel oviparous reproduktion udløst af short-dages fotoperioder, hvor de lå et begrænset antal overvintrende æg ^1,2. I foråret disse æg klækkes at producere den første generation af all-kvindelige bladlus (fundatrices), efter mange runder af parthenogenetisk reproduktion indtil efteråret. Den cykliske partenogenese i bladlus, hvor ukønnede og seksuelle faser suppleant i den årlige livscyklus, er blevet betragtet som en evolutionær nyhed ^1,2. I de parthenogenetisk viviparous bladlus, Embryogenese finder sted inden æg kamre i de æggestokkene tubuli (ovarioles). Derimod udvikler seksuelle oviparous embryoner i befrugtede æg. Bortset fra reproduktive plasticitet, kan bladlus vise transgen e fløj polyphenism: som reaktion på overbelægning signaler og rovdyr trusler, kan de unwinged ukønnede hunner viviparously producerer vingede afkom til langdistance-vandring. Offentliggørelse af genomet sekvens af ært bladlus Acyrthosiphon Pisum -den første genom sekvens for en basal hemimetabolous insekt-tillader yderligere udforskning af reproduktive plasticitet, fløj polyphenism og andre funktioner, herunder insekt-plante interaktioner, viral vectoring og symbiose i bladlus på et molekylært grundlag ^3.

Ud over de genom, er redskaber til karakterisering af genekspression og funktion er nødvendig for at fremme ærten bladlus som en moden model organisme ^4. Vi har beskrevet robuste protokoller af hel-mount <em> in situ hybridisering til påvisning af ekspression af mRNA i bladlus embryoner ^5-7. RNA-interferens (RNAi) via dobbeltstrenget RNA injektion og fodring er blevet anvendt til gendæmpning i bladlus nymfer og voksne, men stabile betingelser for genet knockdown i embryonerne endnu ikke blevet rapporteret ^8-10. Immunfarvning et antistof-tilgang, der kan detektere proteinekspression i prøverne før og efter RNAi knockdown, er blevet udført på ært bladlus embryoner ^11-13. Men forøgelse af vævspermeabilitet og eliminering af baggrundsfarvning er endnu utilfredsstillende anvendelse af standardprotokoller til immunfarvning i ukønnede viviparous embryoner af ærten bladlus. For eksempel fandt vi, at indtrængning af antistof til vævene faldt i gastrulating embryoner (stadie 8-10), og at fostre med morfologisk identificerbare Lemanlæggene (trin 13-14) var knap permeabel for antistof. Desuden blev baggrundsfarvning visualiseret i ukønnede viviparoUS ært bladlus embryoner farvet under anvendelse af antistof mod kimcellelinje markør Vasa såvel som mod Engrailed / Invected protein udtrykt i embryonale segmenter ^12,13. Faktisk baggrundsfarvning var stadig klart synlig i embryoner farvet med det sekundære antistof alene.

For at øge permeabiliteten uden at skade integriteten af ​​bladlus væv, vi titreres forsigtigt koncentrationen af ​​proteinase K og bestemmes optimale betingelser for vævsfordøjelse på bladlus embryoner. For at undgå ikke-specifik farvning i ært bladlus, søgte vi for forbindelser, der effektivt kunne blokere embryoner og undertrykker aktiviteten af ​​endogen peroxidase (POD), et enzym der anvendes til at forstærke signaler i immunfarvning. Et blokerende reagens leveres af en digoxigenin (DIG) -baseret buffer sæt, snarere traditionelt anvendes normalt gedeserum (NGS) / bovint serumalbumin (BSA), reducerede signifikant baggrundsfarvning. Desuden blev fundet at methanol inhibit den endogene POD-aktivitet mere effektivt end hydrogenperoxid (H _{2 O 2).} Detaljer vedrørende disse bladlus-specifikke forhold for immunfarvning på embryoner vil blive beskrevet i de følgende afsnit.

Protocol

1. Kultur Bladlus BEMÆRK:. Laboratoriet stamme af parthenogenetisk viviparous ært bladlus A Pisum oprindeligt blev indsamlet i det centrale Taiwan og er blevet opdrættet på værtsplanter (haven ært Pisum sativum eller brede bønne Vicia faba) under lang dag lysperiode for mere end 300 generationer (en generation: ~ 10 dage). Spiring af frø Soak frøene af værtsplanter i ledningsvand i 3-5 dage ved stuetemperatur. Fyld op med frisk vand en gang om dag…

Representative Results

I denne undersøgelse, udførte vi hel-mount immunfarvning på embryoner af ukønnede ærtelus (figur 1A). Disse kvinder producerer afkom parthenogenetically og viviparously. Disse kvindelige fostre udvikle sig inden æg kamre i de æggestokkene tubuli (ovarioles) (Figur 1B og figur 2A). Inden mikroskopi, dissekerede ovarioles er farvningsresultaterne mål; imidlertid adskillelse af æg kamre er påkrævet for observation af embryoner un…

Discussion

Vi identificerede optimale betingelser er afgørende for en vellykket immunfarvning i ært bladlus A. Pisum, en spirende model organisme til genomiske og udviklingsmæssige undersøgelser ^3,15. Optimerede betingelser for at øge vævspermeabilitet og reducere baggrundsfarvning øget intensitet og specificitet af signaler. De adskiller sig fra standardprotokoller for immunfarvning i andre dyremodeller i de faser, for at skabe porer i cellemembraner og blokering af ikke-specifik antistofbindin…

Materials

30% hydrogen perxidase (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	1.1586E+10	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.