Neuronal गतिविधि के बाह्य रिकॉर्डिंग जाग चूहों में neuroactive पदार्थों के Microiontophoretic आवेदन के साथ संयुक्त

Summary

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Abstract

न्यूरोट्रांसमीटर और neuromodulators, और फलस्वरूप विभिन्न तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की गतिविधि में अंतर, anesthetized और जाग पशुओं के बीच पाया जा सकता है। इसलिए, जाग जानवरों में synaptic प्रणालियों के हेरफेर की अनुमति के तरीकों आदेश में neuronal प्रसंस्करण anesthetics से अप्रभावित को अन्तर्ग्रथनी आदानों के योगदान को निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं। यहाँ, हम इलेक्ट्रोड का निर्माण एक साथ बाह्य तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्ड और जाग चूहों में रिकॉर्डिंग साइटों के आसपास के क्षेत्र में कई neuroactive पदार्थों को रिहा करने के लिए पद्धति प्रस्तुत करते हैं। इन प्रक्रियाओं के संयोजन से, हम चुनिंदा सिर से रोका चूहों के अवर colliculus के न्यूरॉन्स में गाबा _एक रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए gabazine की microiontophoretic इंजेक्शन प्रदर्शन किया। Gabazine सफलतापूर्वक ऐसी आवृत्ति प्रतिक्रिया क्षेत्र और प्रोत्साहन-विशिष्ट अनुकूलन के रूप में तंत्रिका प्रतिक्रिया गुण संशोधित। इस प्रकार, हम दिखाना है कि हमारे तरीके recordin के लिए उपयुक्त हैंजी एकल इकाई गतिविधि और श्रवण प्रसंस्करण में विशिष्ट न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स की भूमिका विदारक के लिए।

वर्णित प्रक्रिया के मुख्य सीमा अपेक्षाकृत कम रिकॉर्डिंग समय (~ 3 घंटा) है, जो रिकॉर्डिंग सत्र के लिए पशु का आदी होना के स्तर से निर्धारित होता है। दूसरी ओर, कई रिकॉर्डिंग सत्रों ही पशु में प्रदर्शन किया जा सकता है। अन्य प्रयोगात्मक न्यूरोट्रांसमिशन या neuromodulation (जैसे प्रणालीगत इंजेक्शन या optogenetic मॉडल के उपयोग के रूप में) के स्तर में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल प्रक्रियाओं पर इस तकनीक का लाभ यह है कि नशीली दवाओं के प्रभाव लक्ष्य न्यूरॉन के लिए स्थानीय अन्तर्ग्रथनी आदानों के लिए ही सीमित है। इसके अलावा, इलेक्ट्रोड के कस्टम निर्माण तंत्रिका संरचना और ब्याज (जैसे रिकॉर्डिंग का संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार के लिए टिप प्रतिरोध के रूप में) के न्यूरॉन के प्रकार के अनुसार विशिष्ट मानदंडों के समायोजन की अनुमति देता है।

Introduction

तंत्रिका उत्तेजना और निषेध की परस्पर क्रिया संवेदी जानकारी ¹ के प्रसंस्करण के लिए मौलिक है। यह भी ज्ञात है संज्ञाहरण cortical सक्रियण और synaptic आदानों ^2,3 के अस्थायी पैटर्न की गतिशीलता पर एक मजबूत प्रभाव पड़ता है। उदाहरण के लिए, यह देखा गया है कि anesthetics cortical न्यूरॉन्स ^3,4 में नेत्रहीन पैदा प्रतिक्रियाओं की अवधि में परिवर्तन। इसके अलावा, उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic सूचनाओं के बीच अनुपात और फेरबदल दोनों पैदा की सहज गतिविधि दरों ^6.7 anesthetized और जाग जानवरों ^4,5 में अलग है। Synaptic conductances मापने के द्वारा, हैदर और उनके सहयोगियों ने ⁴ संज्ञाहरण के तहत आयाम में है कि निषेध मिलान किया उत्तेजना पाया जबकि जागना दौरान, निषेध उत्तेजना की तुलना में मजबूत था। इन निष्कर्षों जाग पशुओं में संवेदी प्रसंस्करण पर विशेष अन्तर्ग्रथनी आदानों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के विकास का संकेत।

<पी वर्ग = "jove_content"> (एनए के आदेश पर) छोटे वर्तमान इंजेक्शन लगाने से आरोप लगाया neuroactive पदार्थों के नियंत्रित इंजेक्शन बड़े पैमाने पर अन्तर्ग्रथनी आदानों के योगदान और संवेदी प्रसंस्करण ^8-13 में ख्यात सेल रिसेप्टर्स की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस तकनीक, microiontophoresis के रूप में जाना जाता है, दर्ज न्यूरॉन, जो एक तेजी से और सीमित प्रभाव के लिए योगदान के आसपास के क्षेत्र में दवाओं के आवेदन की अनुमति देता है। यह प्रक्रिया इस तरह के प्रणालीगत इंजेक्शन, microdialysis या optogenetic तकनीकों के उपयोग के रूप में अन्य प्रयोगात्मक जोड़तोड़ द्वारा हासिल व्यापक प्रभाव की तुलना में, neuroactive पदार्थों के स्थानीय प्रभाव के अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त है। आमतौर पर, एक सूअर का बच्चा वापस इलेक्ट्रोड विन्यास ^14,15 एक साथ लक्ष्य न्यूरॉन रिकॉर्ड और ब्याज की neuroactive पदार्थों वितरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह एक रिकॉर्डिंग एक multibarrel पिपेट neuroactive पदार्थों किया जाता है कि से जुड़ी इलेक्ट्रोड के होते हैं। ओ का संशोधनriginal प्रक्रिया Havey और Caspary ¹⁴ से वर्णित लागू किया गया है। उदाहरण के लिए, एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड, बजाय एक गिलास एक, तंत्रिका गतिविधि ¹⁶ रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। टंगस्टन तार टिप्स, कांच इन्सुलेशन, और टिप जोखिम के समायोजन के electrolytic नक़्क़ाशी रिकॉर्डिंग की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए: टंगस्टन इलेक्ट्रोड ^17,18 के निर्माण के लिए पहले प्रकाशित तरीकों तीन सामान्य चरण शामिल है।

श्रवण तंत्रिका विज्ञान में एक दिलचस्प और आकस्मिक क्षेत्र प्रोत्साहन-विशिष्ट अनुकूलन (एसएसए ¹⁹⁾ का अध्ययन है। सर्व शिक्षा अभियान के दोहराव लगता है कि अन्य, शायद ही कभी प्रस्तुत आवाजों को सामान्य नहीं करता तंत्रिका प्रतिक्रिया में एक विशिष्ट कमी है। सर्व शिक्षा अभियान के महत्व को श्रवण मस्तिष्क में तंत्रिका तंत्र एक अंतर्निहित विचलन का पता लगाने, साथ ही श्रवण की देर बेमेल नकारात्मकता घटक के लिए एक संभव न्यूरोनल सहसंबंधी के रूप में अपनी संभावित भूमिका में रहता पैदा की संभावित ^20,21। सर्व शिक्षा अभियान के ओश्रवण प्रांतस्था ^19,22-24 अप करने के लिए आईसी से ccurs। गाबा _एक मध्यस्थता निषेध सर्व शिक्षा अभियान के ^7,16,25 पर एक लाभ नियंत्रण तंत्र है, जो भी संज्ञाहरण ²⁶ से प्रभावित हो दिखाया गया है के रूप में कार्य करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि पहले और जाग चूहों में गाबा _एक -receptors के एक चयनात्मक प्रतिपक्षी के आवेदन के दौरान आईसी न्यूरॉन्स की एकल इकाई गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए पहले से वर्णित तरीकों को जोड़ती प्रस्तुत करते हैं। सबसे पहले, हम सूअर का बच्चा वापस इलेक्ट्रोड और अगले, शल्य चिकित्सा और रिकॉर्डिंग तरीकों के निर्माण का वर्णन है। दवा रिहाई की प्रभावकारिता के लिए परीक्षण करने के लिए, हम ग्रहणशील क्षेत्र के रूप में अच्छी तरह से पहले और gabazine की microiontophoretic इजेक्शन दौरान आईसी न्यूरॉन्स के सर्व शिक्षा अभियान के स्तर की तुलना में।

Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के अनुमोदन से Salamanca के विश्वविद्यालय में किए गए थे, और के मानकों के अनुरूप तरीकों का उपयोग कर, Salamanca पशु की देखभाल समिति के विश्वविद्यालय के साथ ही यूरोपीय संघ के मानकों (निर्देशक 2010/63 / ई?…

Representative Results

हम आईसी के 4 अच्छी तरह से पृथक न्यूरॉन्स की एकल इकाई गतिविधि दर्ज की गई। जाग चूहों में कोशिकी रिकॉर्डिंग के दौरान प्राप्त विशिष्ट संकेत करने वाली शोर अनुपात चित्रा 3 बी में दिखाया जात…

Discussion

जाग पशुओं में neuroactive पदार्थों के microiontophoresis जांच और एकल न्यूरॉन्स ^40,41 की गतिविधि पर विशेष अन्तर्ग्रथनी आदानों की भूमिका काटना करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस प्रक्रिया anesthetics ?…

Materials

Tungsten wire	Harvard Apparatus LTD	33-0099	0.005 inches x 3 inches
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus LTD	30-0053	Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long
Multibarrel glass capillaries	World Precision Instruments	5B120F-4	5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament
Diaplus	DiaDent	2001-2101	Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette
G-Bond	GC Corporation	2277	Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull
Charisma	Heraeus Kulzer	66000087	Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull
Araldit Cristal	Ceys		2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette
Heating blanket	Cibertec	RTC1
Stereotactic frame	Narishige	SR-6N	Modified for mice
Microiontophoretic device	Harvard Apparatus LTD	Neurophore BH-2	Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module
Multibarrel glass pipette puller	Narishige	Model PE-21
LED lamp	Technoflux	CV-215	5 W, 430-485 nm
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	Flexible plastic needle, 34 AWG
Imalgene	Merial		Ketamine, 100 mg/mL
Rompun	Bayer		Xylazine, 20 mg/mL
Gabazine / SR-95531	Sigma	S106	Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4