Visualisering af Vascular og parenkymale Regeneration efter 70% Delvis hepatektomi i normale mus
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
En modificeret silicone injektion fremgangsmåde blev anvendt til visualisering af den hepatiske vaskulære træ. Denne procedure indeholdt in vivo injektion af silicone forbindelse via en 26 G kateter, ind i portalen eller hepatisk vene. Efter silikone injektion blev organer eksplanteret og forberedt til ex-vivo mikro-CT (μCT) scanning. Den silicone injektion procedure er teknisk udfordrende. Opnåelse et vellykket resultat kræver omfattende mikrokirurgisk erfaring fra kirurgen. En af udfordringerne ved denne procedure indebærer bestemmelse af tilstrækkelig perfusion sats for silikone forbindelsen. Perfusionshastigheden for siliconeforbindelse skal defineres baseret på hæmodynamiske af det vaskulære system af interesse. Upassende perfusionshastighed kan føre til en ufuldstændig perfusion, kunstig dilatation og brud af vaskulære træer.
3D rekonstruktion af det vaskulære system var baseret på CT-scanninger og blev opnået ved anvendelseprækliniske software som HepaVision. Kvaliteten af det rekonstruerede vaskulære træ var direkte relateret til kvaliteten af silikone perfusion. Efterfølgende beregnede vaskulære indikatorer for vaskulær vækst, såsom total vaskulær volumen, blev beregnet på grundlag af de vaskulære rekonstruktioner. Kontrasterende det vaskulære træ med silikone tilladt efterfølgende histologisk oparbejdning af prøven efter μCT scanning. Prøven kan udsættes for seriel sektionering, histologisk analyse og hele diasscanning, og derefter til 3D rekonstruktion af de vaskulære træer baseret på histologiske billeder. Dette er forudsætningen for påvisning af molekylære begivenheder og deres fordeling i forhold til det vaskulære træ. Denne modificerede silicone injektion procedure kan også anvendes til at visualisere og rekonstruere de vaskulære systemer i andre organer. Denne teknik har potentialet til at blive anvendt i udstrakt grad til undersøgelser vedrørende vaskulær anatomi og vækst i forskellige dyr ennd sygdomsmodeller.
Introduction
Lever regenerering er ofte bestemt ved at måle stigningen af lever vægt og volumen og ved at vurdere hepatocytproliferation sats 16. Imidlertid er leverregenerering ikke kun at inducere parenkymal regenerering men også vaskulær regeneration 6. Derfor bør vaskulær vækst undersøges yderligere med hensyn til dets rolle i progressionen af leverregenerering. Visualisering af den hepatiske vaskulære system er afgørende for at fremme vores forståelse af vaskulær regeneration. Talrige indirekte metoder er blevet udviklet til at studere de underliggende molekylære mekanismer for hepatisk vaskulær regeneration. Traditionelt påvisning af cytokiner (vaskulær endotelvækstfaktor VEGF) 14, chemokiner og deres receptorer (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 har været grundpillen for at studere vaskulær regeneration. en 3D-model sammen med kvantitativ analyse af vaskulaturen Imidlertid ville tilføje kritisk anatomiskeoplysninger for at få en bedre forståelse af den vigtige forhold mellem parenkyme og vaskulær regeneration.
At visualisere det hepatiske vaskulære system, som kræver kontrasterende de vaskulære træer blev mus injiceret med en røntgenabsorberende silikonegummi kontrastmiddel direkte i portalen eller hepatisk venøst vaskulære træ. Efter polymerisation af silicone og eksplantation af organet, blev leverprøverne underkastet μCT scanning under anvendelse af en CT-scanner. Scanningerne resulterede i voxel billedrepræsentationer af silicone-injektion prøver 9.
For kvalitetskontrol, blev det vaskulære system først visualiseret i 3D ved hjælp af præklinisk software. Segmentering blev udført ved at sætte en tærskel mellem det bløde væv intensitet og fartøjet intensitet. Den resulterende beholder maske blev visualiseret under anvendelse overfladegengivelse. Den software også tilladt til manuel bestemmelse af to parametre Vascular vækst: maksimal fartøjets længde og radius.
En præklinisk software blev derefter anvendt til 3D-rekonstruktion af vaskulære træer og efterfølgende beregning af leverandør- eller dræner vaskulære territorier 13. Desuden denne software bestemmes automatisk visse parametre af vaskulær vækst, såsom den samlede længde af alle synlige vaskulære strukturer også kendt som den totale kant længde eller totalvolumen fartøj.
Proceduren silikone perfusion blev udført i naive mus og i mus, der undergik 70% partiel hepatektomi (PH). Levere blev opsamlet på forskellige observation tidspunkter efter resektion til analyse vaskulære og parenkym leverregenerering hjælp af førnævnte visualisering og kvantificering teknik.
De vigtigste mål for denne film er at: (1) demonstrere den delikate injektion-teknik der kræves for at opnå optimal kontrastfyldte og (2) viser den potentielle fordel deraf frabout en detaljeret analyse af de resulterende prøven ved hjælp μCT og histologiske serielle sektioner. Efter at have set denne film, skal læseren have en bedre forståelse af, hvordan at injicere silikone forbindelse til en bestemt karsystem og om nytten og anvendeligheden af teknikken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kontrasterende det vaskulære træ ved silikone injektion og μCT scanning er blevet indført i tumormodeller og neurologiske sygdomsmodeller ofte for at studere den angiogene progression 5,7,8,10. Forbedringer i metodologi af silikone injektion blev foretaget i denne undersøgelse til at visualisere og kvantificere vaskulær vækst efter delvis hepatektomi hos mus.
Der er en række kritiske trin kræver opmærksomhed for at opnå god perfusion kvalitet. Først og fremmest er syst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
References
- Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
- Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
- Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
- Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
- Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685 (2012).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
- Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
- Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
- Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
- Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10 (2013).
- Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
- Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
- Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
- Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
