マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

Summary

ここでは、実験用マウスから後肢の長骨(大腿骨と脛骨)を解剖するためのプロトコルを提示します。さらに、骨髄空間から骨髄を除去するために遠心分離を利用する、これらの骨からの骨髄分離のための迅速な技術について説明します。

Abstract

骨髄の調査は、基礎骨生物学、免疫学、血液学、癌転移、生体力学、幹細胞生物学など、多くの研究分野で重要です。しかし、健康で病的な状態における骨の重要性にもかかわらず、骨解剖と骨髄分離の専門知識が不足しているため、骨はほとんど研究されていない臓器です。マウスは、骨および骨髄への影響を研究するための一般的なモデル生物であり、大規模な実験コホートの処理のために、長骨解剖および骨髄分離のための標準化された効率的な方法が必要です。大腿骨と脛骨を切除するための簡単な解剖手順について説明し、組織形態学的分析や強度試験など、下流のアプリケーションに適しています。さらに、細胞選別、初代細胞培養、DNA、RNA、タンパク質抽出に最適な、限られた処理時間で遠心分離により長骨から骨髄を分離するための迅速な手順を概説します。このプロトコルは、サンプルの迅速な処理のために合理化され、実験エラーを制限し、ユーザー間のばらつきを最小限に抑えるために標準化されています。

Introduction

長骨と骨髄の細胞の研究は、骨生物学、癌生物学、免疫学、血液学、生体力学など、無数の研究分野の中心です。骨は非常にダイナミックな器官であり、軟骨とともに骨格を形成し、内臓の負荷と保護に対する機械的サポートを提供します。さらに、骨のミネラル成分は、重要なシグナル伝達分子であるカルシウムとリン、およびその他の因子の貯蔵シンクです¹。最後に、骨は骨髄を収容し、代謝活性のある骨形成骨芽細胞および骨吸収性破骨細胞とともに、造血細胞およびリンパ細胞集団の維持に必要な幹細胞ニッチを提供します。

骨髄は多くの障害で影響を受け、しばしば骨髄機能障害、重度の骨痛、病的骨折を引き起こします。骨は、多くの固形腫瘍、特に乳がんや前立腺がんによく見られる転移部位であり、腫瘍細胞が骨髄ニッチに直接関与して骨転移の悪循環を開始し、造血幹細胞を置換します^2,3。骨髄腫や白血病などの造血器悪性腫瘍は、骨髄機能障害と健康な骨リモデリングの調節緩和を特徴としています¹。変形性関節症、骨粗鬆症、脊柱側弯症、くる病など、他の非悪性骨格障害も活発な研究分野です。他の点では健康な個人でさえ、骨の生体力学的障害は痛みを伴う骨折につながります。これらの障害はすべて、罹患率と死亡率を減らすための新しい予防策と治療計画を特定することを目的とした活発な研究分野を表しています。

骨髄の広範な役割を研究するためには、大規模なin vivo実験を迅速に処理するために、研究者がマウスの長骨を解剖するためのシンプルで効率的な標準化された方法を持つことが重要です。ここで概説されている解剖プロトコルは、ex vivoイメージング、組織学、組織形態測定、強度試験など、すべての長骨分析に適しています。同様に、蛍光活性化セルソーティング(FACS)や定量PCR(qPCR)などの実験的解析や、骨髄細胞の初代細胞培養などのダウンストリームアプリケーションには、骨髄細胞の回収率が高く、ユーザー間のばらつきが少ない標準化された骨髄単離法が重要です。

Protocol

すべての動物の作業は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用のためのガイドで概説勧告に従って施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1.後肢長骨の解剖

1. 施設の指針に従ってマウスを安楽死させます。
2. 仰臥位でマウスを合わせ、足関節以下のマウスの足のパッドを介してすべての4脚を固定することによって貼り付けます。
3. 徹底的に足をdousing、70％エタノールでマウスをスプレーします。
4. ちょうど腰の上に、下腹部正中線の右側に小さな切開を行います。
5. 脚のダウンと足首関節過去の切開を拡張します。
6. 皮膚を引いて、ボードから45度の角度でピンを配置し、大腿骨の前方側を露出させ、脚部からピンに大腿骨の近位端に固定された大腿四頭筋を切りました。
7. 宣伝ちらしと大腿骨の後部側面にはさみのeは、離れて膝関節からのハムストリングスにカット。
8. ボードから45度の角度でピンを配置し、大腿骨の後側を露出させ、脚部からピンに大腿骨の近位端に固定され、皮膚とハムストリングの筋肉を引き戻します。
9. ピンセットで、ちょうど膝関節の上に、大腿骨の遠位端部を保持します。大腿骨自体にカットしないように注意して、股関節に向かって大腿骨シャフトの両側にハサミの刃を案内します。
10. 少し開いハサミで示される大腿骨頭を、到達した後、大腿骨頭下の骨をスナップしないように注意して、大腿骨を脱臼する大腿骨頭の真上に移動ハサミのトップブレードではさみをねじります。
11. ピンセットで大腿骨シャフトの上部をつかみ、寛骨臼からそれを解放するために離れて大腿骨頭から軟部組織を切断します。
12. 含め、全体の足の骨を引っ張りますアップや身体から離し大腿、膝、および脛骨、慎重に皮膚に足を接続する結合組織と筋肉を切り取ります。
13. 足首関節を使い過ぎると再び脛骨を脱臼するねじれ運動にはさみを使用しています。
14. 、脛骨の遠位端を把握腱を切断しないように注意しながら、アップと離れて本体とピンボードから脛骨を引き出します。
15. 膝のマウスに、長骨を取り付ける任意の残りの結合組織をカット。
16. 任意の追加の筋肉や大腿骨と脛骨に付着した結合組織を削除します。
17. （組織学、組織形態計測、生体力学的試験、 など 。）、無傷のままに骨を必要とするアプリケーションの場合^、（4-7のように）標準的な社内のプロトコルを進めます。骨髄を単離するために、セクション2に進んでください。

骨髄の単離2.長骨の準備

1. 鉗子の使用、膝蓋骨は反対側で大腿骨を把握ndは近位端部（大腿骨頭）ダウン。
2. 膝関節を使い過ぎると脛骨と大腿骨を脱臼するねじれ運動にはさみを使用しています。
3. 一緒に大腿骨と脛骨を保持する任意の結合組織をカット。
4. 鉗子を使用して、反対の前方側と近位端（大腿骨頭端）ダウンして大腿骨を把握します。
5. 顆の大腿骨軸をはさみを導きます。
6. ゆっくり顆、膝蓋骨、そして骨幹を公開する骨端を除去するために、前後にはさみを回転させます。
7. 任意の追加の筋肉や鉗子、はさみ、およびキムワイプを使用して大腿骨に付着し結合組織を削除します。
8. 鉗子を使用して、反対の前方側と先端（足首端）ダウンと脛骨を把握します。
9. 脛骨骨端が無傷である場合は、顆に脛骨の軸をはさみを導きます。
10. ゆっくりmetaphを露出するように顆と骨端を除去するために、前後にはさみを回転させますysis。
11. 追加の筋肉または鉗子、はさみ、およびキムワイプを使用して脛骨に付着した結合組織を取り除きます。

3.骨髄単離

1. 0.5ミリリットルマイクロチューブの底から18 G針を押してください。
2. チューブに長骨（2大腿骨の最大値と2脛骨）を配置し、膝エンドダウンダウン終了し、ふたを閉めます。
3. ネスト1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中の0.5 mlのマイクロ遠心チューブ。
4. 15秒間微量で≥10,000×gで、ネストされたチューブを遠心。
5. 骨髄は目視検査により骨のスピンアウトされていることを確認します。骨は白表示され、より大きなチューブに大きな視覚的にペレットがあるはずです。
6. 骨0.5 mlマイクロチューブを捨てます。
7. 、適切な溶液中での骨髄（ 例えば 、PBS、培地、FACSバッファー）を中断し、実験プロトコル（DNA、RNA、またはタンパク質の分離を進めますFACS分析、または初代細胞培養）。

Results

ここで説明するプロトコルは、骨組織への損傷を最小限に抑えて、マウスの大腿骨と脛骨の迅速な解剖のために最適化されています。 、および組織学（ 図^1C）4,7 -この技術はバイオメカニクス研究、組織形態計測（B図1A）を含む下流の分析の数、に適しています。代表histomophometric micoCT 3D再構成（ 図1A - B）は、海綿骨と皮質シェルの両方が小柱数、厚さ、及び間隔を含む骨組織形態計測のための標準化された構造パラメータの正確な定量が可能になり、その維持されていることを示しています。骨量;その他の措置⁸の中で、皮質の厚さ、。代表的な組織学的セクションでは、H＆E染色したホルマリン固定し、脱灰脛骨（ 図1C）を示しています。画像は石灰化bの両方の完全性を実証します1および組織学的分析のための細胞の骨髄。

骨髄の単離手順は、骨髄空間の無菌性を維持し、汚染を低減するために低い処理を有し、したがって、骨髄収率の損失を低減すること、長骨の切断を必要としません。この骨髄⁵及びPCR分析、フローサイトメトリーを含む多くの下 ​​流の用途に適しています。 ^4,6 -また、この手順は、破骨細胞および骨芽細胞（B図2A）を含む骨髄細胞の初代細胞培養物のための骨髄を単離することができます。

図1.組織形態学的およびマウスの長骨の組織学的分析。（A）は、外側皮質殻を示すマウスの脛骨の3次元マイクロCT再構成および（B trong>）骨梁（スケールバー= 0.5ミリメートル）。 （C）脱灰と切片脛骨（4倍）の組織学的H＆E染色。画像キャサリンWeilbaecher、医学、アメリカのワシントン大学の礼儀。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

破骨細胞と骨芽細胞の分化のための図2.初代骨髄細胞培養。破骨細胞形成メディア（4倍速）で7日後の多核破骨細胞のための（A）TRAP染色。 （B）骨芽細胞および骨形成培地で21日後の石灰化のためのアリザリンレッド（赤色）染色のためのアルカリホスファターゼ（紫色）。キャサリンWeilbaecher、医学、アメリカのワシントン大学の画像が礼儀。ジル/ ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

マウスの後長骨を除去し、その後の骨髄を分離するための簡単で効率的な方法を紹介します。この方法は、骨と骨髄の高い構造的および細胞的完全性を維持し、処理時間が短いため、下流の分析に影響を与える可能性のあるユーザー誘発性骨折や骨スコアリングの可能性が最小限に抑えられます。さらに、骨髄を分離するための遠心分離法では、骨を切断して骨髄空間を露出させたり、骨髄を洗い流すために液体を流したりする必要がないため、潜在的な汚染点が減少します。さらに、遠心分離機技術は、他の方法よりもハンズオン時間が短く、比較的高スループットであるため、処理時間が短縮されます。

マウス間の表現型の変動が大きいため、in vivo マウス研究には高い変動が固有です。高価で労働集約的なマウス研究の研究効果を最大化するためには、技術的な実験エラーを最小限に抑えることが重要です^9,10。動物の犠牲から下流の分析または組織固定までの時間は、微妙な変化を克服し、グループ間の大きな違いを減らす可能性のある実験的変動をもたらします。したがって、正確なデータ分析にはサンプルの迅速な処理が不可欠です。ここで説明する長骨解剖および骨髄分離技術は、技術的なばらつきを減らすために、動物やサンプルの迅速な処理に最適化されています。

このプロトコルは、骨組織自体の調査や骨髄の細胞の調査など、多くの研究分野に広く適用できます。さらに、長い骨解剖に対するこの単純なアプローチにより、関連分野の研究者は、他の方法では十分に研究されていない病状における骨髄機能障害に関する知識を広げるために、骨の寄与を直接調査できるようになります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ピンボード
ピン
70%エタノール
解剖はさみ
解剖鉗子
Kimwipesキン	バリークラーク	34120
16 G針
1.5 mlマイクロ遠心チューブ
0.5 mlマイクロ遠心チューブ